引用本文
黄韵, 戴越刚, 王剑, 顾岚. 儿童系膜增生性肾小球肾炎红细胞免疫黏附功能的实验研究. 28(11): 992-994[HUANG Yun, DAI Yuegang, WANG Jian, GU Lan. The experimental study in erythrocyte immuno-adhering function of children patients with mesangio-proliferative glomerulonephritis. 上海检验医学, 28(11): 992-994]  
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儿童系膜增生性肾小球肾炎红细胞免疫黏附功能的实验研究
黄韵1, 戴越刚1, 王剑2, 顾岚3
1. 上海浦东新区浦南医院检验科,上海 200127
2. 上海市儿童医学中心检验科,上海 200127
3. 上海市长海医院儿科,上海 200433
摘要
目的

从红细胞免疫角度探讨儿童系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)的免疫发病机制。

方法

检测34例MsPGN患儿的红细胞C3b受体花环率(RCR)、肿瘤红细胞花环率(TRR)作为红细胞免疫黏附功能指标;聚合酶链反应(PCR)联合Hind Ⅲ酶切技术测定红细胞第1补体受体(CR1)密度相关基因多态性(HH型、HL型、LL型)。

结果

MsPGN患儿的RCR、TRR均低于正常儿童(P<0.01);MsPGN患儿红细胞CR1密度相关基因多态性分布以HH型占大多数,但百分比较对照组明显下降(P<0.05),未检出LL型。在相同基因人群中,MsPGN患儿TRR明显低于对照组(P<0.01);无论是MsPGN组还是对照组,HH型TRR均比HL型高(P<0.01)。

结论

MsPGN患儿红细胞膜上CR1活性降低,识别、黏附、清除免疫复合物(IC)的能力下降,循环中的IC在肾小球滤过时沉积于系膜区,引起系膜细胞增生反应,MsPGN患儿红细胞免疫黏附功能显著下降在该病的发病机制中起重要作用。红细胞CR1密度相关基因型别与红细胞免疫黏附功能有关,MsPGN患儿红细胞免疫功能下降可能为继发性下降。

关键词: 红细胞; 免疫功能; 第1补体受体; 系膜增生性肾小球肾炎; 儿童
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)11-0992-03
The experimental study in erythrocyte immuno-adhering function of children patients with mesangio-proliferative glomerulonephritis
HUANG Yun1, DAI Yuegang1, WANG Jian2, GU Lan3
1.DepartmentofClinicalLaboratory,PudongNewAreaPunanHospital,Shanghai 200127,China
2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiChildren'sMedicalCenter,Shanghai 200127,China
3.DepartmentofPaediatrics,ChanghaiHospital,Shanghai 200433,China
Abstract
Objective

To investigate the mechanism of erythrocyte immuno-adhering in the pathogenesis of mesangioproliferative glomerulonephritis(MsPGN).

Methods

The erythrocyte immuno-adhering function was measured in 34 children patients with MsPGN. Red blood cell C3b receptor rosette (RCR) and tumor red blood cell rosette (TRR) were determined. The complement receptor type 1(CR1)density-associated genotypes (HH type, HL type and LL type) on erythrocyte were determined by polymerase chain reaction (PCR) amplification with Hind Ⅲ restriction enzyme digestion technique.

Results

RCR and TRR of the children patients with MsPGN were lower than those of healthy children (P<0.01). The most CR1 density-associated genotype on erythrocyte of the children patients with MsPGN was HH type, and HH type percentage of the children patients with MsPGN decreased significantly(P<0.05). No LL type was determined. TRR of the children patients with MsPGN was lower than that of healthy children with same genotype(P<0.01). TRR of HH type was higher than that of HL type (P<0.01).

Conclusions

The decreasing activation of erythrocyte CR1 induces low capacities of identifying,adhering,clearing immunocomplex(IC),which lead to the deposit of glomeruli and the proliferation of mesangial cells. The decrease of erythrocyte immuno-adhering function plays an important role in the pathogenesis of MsPGN. The results of CR1 density-associated genotypes are correlated with the ability of erythrocyte immuno-adhering function. There will be the secondary decrease of erythrocyte immuno-adhering function of MsPGN.

Keyword: Erythrocyte; Immune function; Complement receptor type 1; Mesangioproliferative glomerulonephritis; Child
引言

红细胞是人体免疫系统的重要组成部分之一,主要通过细胞膜上的第1补体受体(complement receptor type 1, CR1,又称C3b受体)发挥免疫黏附功能。红细胞免疫功能与CR1数量及活性密切相关[ 1]。我们采用花环法、聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)联合Hind Ⅲ酶切技术,分别检测系膜增生性肾小球肾炎(mesangioproliferative glomerulonephritis,MsPGN)患儿红细胞免疫黏附功能以及红细胞CR1密度相关基因型,从细胞黏附水平和基因水平初步探讨红细胞CR1密度相关基因型与红细胞黏附功能的关系,以及后者在儿童MsPGN发病机制中的作用。

材料和方法
一、研究对象

选取34例在上海市儿童医学中心肾病专家门诊随访的MsPGN患儿(MsPGN组)34例,其中男20例,女14例,年龄4~14岁。另随机选取门诊体检正常儿童(对照组,无免疫系统疾病,1个月内无其他疾病)30名,男16名,女14名,年龄6~12岁。临床诊断根据全国小儿肾脏疾病协作组2001年诊断标准,临床表现均为单纯性血尿,其中肉眼血尿11例,镜下血尿23例,不伴有其他免疫系统疾病。抽血时间在确诊后、治疗前,血压、红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白及肾功能等均在正常范围内。所有患儿均经肾穿刺病理证实为MsPGN。病理分型根据肾小球疾病病理分类(中华医学会儿科学会肾脏病学组1996)执行[ 2]。所有患儿系膜增生程度均为中度。

二、方法

红细胞天然免疫黏附功能测定:在患儿诊疗前抽取外周血1 mL(109 mmol/L枸橼酸钠抗凝),在室温下,3 000× g水平离心5 min,使红细胞沉淀。取沉淀的红细胞5 μL,加入400 μL生理盐水混匀,制备红细胞悬液。37 ℃溶解艾氏腹水癌细胞和肿瘤细胞,用生理盐水8~10 mL洗涤1次,加入1.5 mL生理盐水充分混匀,制备艾氏腹水癌细胞悬液和肿瘤细胞悬液。取100 μL第1次离心后的自身血浆上清液置入编号试管,分别加入红细胞悬液50 μL和肿瘤细胞悬液、艾氏腹水癌细胞悬液各100 μL,混匀后37 ℃水浴30 min,加缓冲液3滴,轻轻混匀,4 ℃过夜。取混匀液150 μL置玻片中间,加1滴染液,水平悬浮,涂开至玻片2/3,阅片,光镜下计数200个红细胞,1个红细胞结合5个及以上酵母或1个癌细胞结合5个及以上红细胞为1朵花环。计算百分率,分别为红细胞C3b受体花环率(red blood cell C3b receptor rosette, RCR)、肿瘤红细胞花环率(tumor red blood cell rosette, TRR)[ 2, 3]。

CR1密度相关基因多态性测定:采用碘化钠法提取基因组DNA。取40 μL乙二胺四乙酸抗凝的外周血0.5 mL于离心管,加6 mol/L碘化钠40 μL,漩涡震荡15 s。加氯仿:异戊醇(24∶1)80 μL,震荡15 s,10 000× g水平离心5 min,取上清40 μL于另一离心管中,加异丙醇24 μL,混匀,静置3 min,10 000× g水平离心5 min,弃上清,加37%异丙醇70 μL,10 000× g水平离心5 min,弃上清,于60 ℃烤箱烘干,加8 μL双蒸水溶解。引物1∶5'-CCTTCAATGGAATGGTGCAT-3'(4 415~4 435 bp);引物2:5'-CCCTTGTAAGGCAAGTCTGG-3'(引物3'端距结构基因内含子Hind Ⅲ酶切位点25~55 bp)。进行PCR扩增,DNA模板3.0 μL, 引物1和2各取 0.3 μL,终浓度均为0.125 μmol/L,耐热DNA集合酶0.6 μL,总反应体积30 μL,加灭菌石蜡油30 μL覆盖于混合液上,93.5 ℃变性225 s后按93.5 ℃ 60 s、60 ℃ 50 s、72 ℃ 50 s进行30个循环,72 ℃延伸5 min,然后Hind Ⅲ酶切(37 ℃水浴2 h)、琼脂糖凝胶电泳(100 V电泳30 min),出现1条1.8 kb带为HH型,出现1.8、1.3和0.5 kb 3条带为HL型,出现1.3和0.5 kb 2条带为LL型。全部试剂由上海儿童医学中心免疫室提供。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0软件统计。检测结果以 ±s表示,各组间红细胞CR1基因组密度多态性分布百分比的比较用 χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、MsPGN患儿红细胞天然免疫黏附功能的变化

MsPGN患儿红细胞天然免疫黏附补体致敏的酵母多糖和艾氏腹水癌细胞的能力均明显低于正常儿童( P<0.01)。见表1:

表1 MsPGN组和对照组红细胞免疫功能变化( ±s,%)
二、MsPGN患儿红细胞CR1密度相关基因多态性的变化

34例MsPGN患儿红细胞CR1密度相关基因多态性分布为:HH型85.30%(29/34),明显低于正常儿童的96.67%(29/30, P<0.05)。见表2:

表2 MsPGN组和对照组红细胞CR1密度相关基因多态性分布比较
三、CR1基因组型别不同者和组别不同者TRR结果分析

与正常儿童比较,MsPGN患儿红细胞CR1密度相关基因多态性不仅高表达的百分比下降,而且在同组别中,HH型者TRR均比HL型高( P<0.01)。见表3:

表3 MsPGN组与对照组CR1基因组型别不同者和组别不同者TRR结果( ±s,%)
讨论

MsPGN是我国儿童肾脏疾病常见的病理类型之一。目前认为免疫复合物(immunocomplex, IC)为主要致病因素。 影响IC在肾小球沉积的因素主要是机体清除IC的能力[ 4]。经研究证实,人体循环中IC的清除主要是由红细胞完成的。红细胞通过CR1同IC上的C3b结合使之失去活性,继而被运送至肝脾网状内皮系统吞噬销毁[ 5]。因此红细胞在机体IC的清除中有极其重要的作用。本研究发现,在MsPGN患儿中, RCR和TRR较对照组显著下降( P<0.01),说明这是继发性的红细胞免疫功能损害,患儿红细胞膜上CR1活性降低,识别、黏附、清除IC的能力下降,循环中的IC在滤过肾小球时沉积于系膜区,引起系膜细胞增生反应,从而构成系膜增生性肾小球肾炎的病理组织学表现[ 6, 7]。因此在MsPGN的发病机制中,红细胞免疫功能受损是一个十分重要的因素。

红细胞CR1的活性与数量密切相关,而CR1数量的多少是由基因组中CR1密度相关遗传结构所决定。人CR1由2个等位基因共同编码,位于1号染色体补体激活调节因子区(RCA)等位基因的7.4和6.9 kb Hind Ⅲ片段,分别与红细胞CR1高数量(H)和低数量(L)表达有关[ 8]。在本研究中发现MsPGN患儿HH型人数百分比较正常儿童减少,HL型增多,说明该人群中红细胞CR1基因组点突变率明显上升。但由于MsPGN组的HH型仍高达85.30%,可见MsPGN患儿红细胞膜上CR1活性下降大部分是继发性的。从红细胞CR1基因密度多态性型别与黏附肿瘤细胞能力高低关系分析,发现MsPGN患儿HH型TRR明显高于HL型,而红细胞CR1基因组密度多态性型别相同的不同人群中红细胞免疫黏附肿瘤细胞能力高低差异很大,MsPGN组的TRR明显低于对照组,说明在MsPGN的发病过程中,疾病因素如IC与CR1的相互作用、炎症介质的影响及红细胞免疫调节因子的改变,会使红细胞CR1活性下降,黏附肿瘤细胞能力减弱,这不仅与遗传因素有关,也与后天影响有关。扩大MsPGN的检测人数、探讨红细胞CR1基因组缺陷与MsPGN易感性的关系以及红细胞CR1基因组表达的家系调查是值得进一步深入研究的。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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