超速离心法分离脂蛋白是在对样本添加如溴化钠或溴化钾等盐类调整样本密度后,根据漂浮或沉淀部分密度与水的密度的差异利用平衡法和速率法进行分离。脂蛋白的制备分离可通过将血清或血浆置于无蛋白质溶液(密度为1.006 kg/L)中超速离心,使富含TG的极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)和乳糜微粒漂浮,并使用移液器或吸管回收。1.006 kg/L超速离心的下层部分[包括LDL、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、中密度脂蛋白(intermediate-density lipoprotein,IDL)和脂蛋白(a)]可通过添加溴化钾等盐类将密度调整至1.063 kg/L进行超速离心使LDL部分漂浮,其中胆固醇的含量就是LDL的检测结果^{[ 10]}。

作为一种分离技术,超速离心法不仅步骤繁琐、耗时,而且分离得到的不稳定的脂蛋白还可能因盐类浓度和离心力等因素而改变。另因超速离心法需要大量不同类型的仪器和试管,不同检测批次的实验环境存在一定差异,分离结果的质量高度依赖于技术人员的实际操作等原因导致超速离心法的重复性较差,交叉污染较多,且技术要求高,很难在临床实验室开展。但是,超速离心法仍作为参考方法的基础。首次将超速离心法和沉淀法结合的LDL-C研究方法被命名为BQ(beta quantification)法,是NCEP推荐的LDL-C检测的二级参考方法。BQ法首先使用1.006 kg/L的密度进行超速离心,分离漂浮的VLDL及乳糜颗粒,检测下层部分中总的胆固醇,再使用肝素锰将下层部分中的LDL-C[含有IDL和脂蛋白(a)]沉淀,检测HDL-C。LDL-C为下层总的胆固醇减去HDL-C。此外还使用电泳技术(定性)及检测VLDL与TG的比值(定量)来分析Ⅲ型高脂蛋白血症患者中的异常β-VLDL。样本量减少和分离时间缩短的改进进一步提高了BQ法的便利性^{[ 11]}。

1965年Fredrickson等^{[ 12]}根据纸质电泳得到的脂蛋白分离结果提出一种用于高脂蛋白血症分级的分型系统。随后更为便捷的醋酸纤维素薄膜电泳^{[ 13]}和聚丙烯酰胺凝胶电泳^{[ 14]}也被使用。首个定量电泳检测方法是使用琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白,利用多聚阴离子沉淀^{[ 15]}后,使用光密度扫描得到可靠的结果^{[ 16]}。LDL-C结果还可根据与BQ法对比的校正公式进行校准^{[ 17]}。但是脂蛋白异常的样本仍会出现误差,如脂蛋白(a)条带会共迁移到前β条带^{[ 18]}。

随着电泳技术的发展,使用胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和氨基乙基咔唑染料的电泳方法开始用于脂蛋白的检测^{[ 19]}。电泳法的胆固醇检测线性可达4 000 mg/L,每一条带的最低检出限为42 mg/L,不精密度尚可[变异系数(coefficient of variation, CV)<3.3%]。与BQ法检测结果相比,LDL-C的平均偏倚为2.9%,总误差为7.8%。对于TG在2 000~4 000 mg/L和>4 000 mg/L的样本,其偏倚分别升高至5.5%和6.9%^{[ 19]}。与根据NCEP的LDL-C医学决定水平分级结果相比,68%的个体分级一致。事实上,95.7%的个体分级与NCEP分级相比一致或在临近的分组内^{[ 19]}。

电泳法不仅能够对主要的脂蛋白进行定量检测,还可直接观察不同的脂蛋白变化。电泳法是检测Ⅲ型高脂蛋白血症患者特征性宽β条带的确诊试验。与使用酶法和免疫化学法检测脂蛋白的自动化仪器相比,电泳法检测脂蛋白需要较多的工作人员且操作技术要求较高,因此不适用于样本量较大的常规实验室,相对适用于某些特殊的专业实验室。

1969年Friedewald和Levy发现:(1)除Ⅲ型高脂蛋白血症患者外,所有脂蛋白正常或高脂蛋白血症患者的极低密度脂蛋白胆固醇(very low-density lipoprotein cholesterol,VLDL-C)中TG和胆固醇比例均为5∶1;(2)无乳糜微粒的情况下,血浆中大多数TG均含有VLDL-C。研究发现通过直接检测血浆TC和HDL-C并将TG检测结果除以5,可能可以合理地估算出剩余LDL-C的含量^{[ 20]}。Friedewald于1972年将这一计算公式的研究发表于《Clinical Chemistry》,开启了LDL检测的新篇章^{[ 8]}。Friedewald公式为:LDL-C=TC-[HDL-C+TG(mg/L)/5或TG(mmol/L)/2.2]。

Friedewald等^{[ 20]}在最初发表的文章中提到了Friedewald计算法的不足之处:由于乳糜颗粒与VLDL相比含有胆固醇相对较少,因此乳糜颗粒的存在会导致VLDL-C结果假性增高而LDL-C结果假性减低。因非空腹状态样本中常含有乳糜颗粒,所以使用Friedewald计算法检测LDL-C需要空腹样本(建议患者空腹12 h以上)。与乳糜颗粒类似,TG浓度过高的样本会导致VLDL中胆固醇与TG的比例相对下降,影响LDL-C结果计算。因此建议TG<4 000 mg/L的样本使用Friedewald计算法检测LDL-C。以残留脂蛋白聚集为特征的Ⅲ型高脂蛋白血症患者和异常β脂蛋白血症患者胆固醇相对TG的比例异常升高,也会对Friedewald计算法检测LDL-C结果造成影响。Jialal等^{[ 21]}发现12位Ⅲ型高脂蛋白血症患者使用BQ法检测LDL-C结果均值为1 207 mg/L,而Friedewald计算法的结果均值为2 207 mg/L,2种方法检测结果差异非常明显。

Friedewald计算法检测LDL-C还有一个缺陷,就是TG、TC和HDL-C结果的变化均会影响LDL-C的结果。NCEP专家组发现经验丰富、标准化程度较好的脂质检测实验室Friedewald计算法检测LDL-C结果在1 000~2 250 mg/L间样本的 CV平均为4%(2.7%~6.8%)^{[ 22]}。常规实验室的差异率更高。美国病理学家协会(College of American Pathologist,CAP)对超过1 150家实验室的8个调查样本结果显示 CV平均为12%^{[ 22]}。 CV不仅反映了实验室间的不精密度,也说明不同TC、TG和HDL-C检测试剂间的偏倚较大。

Friedewald计算法检测LDL-C结果准确性的一个重要指标是其与NCEP的LDL-C医学决定水平分级的一致性。2个约1 000名受试者的研究发现,86%~88%的受试者Friedewald计算法检测LDL-C结果分级与使用BQ法的NCEP分级(<1 300、1 300~1 600和>1 600 mg/L)结果一致^{[ 23, 24]}。5%的受试者Friedewald计算法检测LDL-C结果分级与NCEP分级相比低一级,而6%的受试者Friedewald计算法检测LDL-C结果分级相对高一级。仅有0.4%的受试者Friedewald计算法检测LDL-C结果分级与NCEP分级差异超过2级,这些受试者均为Ⅲ型高脂蛋白血症患者^{[ 23]}。这些研究均是由经验丰富的特殊脂质实验室完成,可能不能完全代表常规临床实验室的检测水平。

使用Friedewald计算法对TG<2 000 mg/L的样本检测LDL-C,其结果是十分可靠的。对于TG浓度在2 000~4 000 mg/L间的样本,大多数计算法检测结果是可靠的,但仍有某些特殊患者(如Ⅱ型高脂蛋白血症患者)结果存在一定偏倚。对于TG>4 000 mg/L、存在乳糜颗粒或Ⅲ型高脂蛋白血症患者的样本,使用Friedewald计算法检测LDL-C的结果是不可信的。

虽然Friedewald计算法存在很多限制条件和需要改进的方面,但仍被大多常规临床实验室广泛应用。NCEP的脂质检测专家小组建议在直接法检测LDL-C达到检测标准后,使用直接法代替Friedewald计算法应用于临床LDL-C检测。

在NCEP建议使用直接法检测LDL-C之前,很多试剂公司已经开始研发LDL-C检测试剂。通过加入特定试剂,使LDL颗粒形成特异性沉淀。不同试剂公司使用的添加物各不相同,如Merck公司在pH值5.12时加入肝素;Roche公司加入聚乙烯硫酸钾;Progen公司加入葡聚糖硫酸酯等^{[ 25]}。通过离心使LDL沉淀部分沉积于试管底部后,对血清TC和上层悬浮液(无LDL部分)的胆固醇进行检测,计算两者差值可以得到沉淀部分的LDL-C含量。此外,还可以通过直接检测溶解后的沉淀物得到LDL-C的结果。早期的沉淀法检测LDL-C并不能替代便捷的Friedewald计算法,也无研究表明与计算法相比具有更好的精密度、准确性和特异性。

1994年Genzyme Diagnostics and Sigma Diagnostics研发的商品化试剂Direct LDLTM面世。这一试剂不再使用分层技术,而是利用可与聚苯乙烯胶乳磁珠结合的多克隆羊抗人apo A-I和apo E抗体,设计去除乳糜颗粒、HDL、VLDL和IDL颗粒,进而直接检测LDL-C部分^{[ 26]}。这一分离方法特异性针对LDL,但是高TG血症患者样本仍会有VLDL影响检测结果^{[ 21]}。多项研究发现免疫分离法批间 CV为2.0%~5.2%,总误差均值为13.8%(11.8%~15.1%)。样本可在4 ℃条件下保存至多3周,但样本冻融仍会影响检测结果^{[ 27]}。此外,还有使用简易磁珠沉淀方法的免疫分离法,能够提高样本处理效率,但仍需要较大的样本吸样量和特殊的仪器,并且特异性仍有待进一步提高。

在HDL-C均相法面世后,1998年日本科学家Sugiuchi等^{[ 28]}首先报道了利用均相法直接检测LDL-C。均相法直接检测LDL-C的最大优点是可以实现LDL-C检测全自动化。全自动化检测可以自动化吸样、控制反应时间和温度,这均可以提高LDL-C检测的精密度。均相法可以提高LDL-C检测的检验质量,进一步能够达到NCEP专家组提出的检测标准和建议。最初推出均相法LDL-C商品化试剂的公司有Kyowa Medex、Daiichi、Wako、Denka Seiken和International Reagents Corp。这些试剂均包括不同的清洗剂和其他化学成分,通过阻断、溶解不同类别的脂蛋白以获得LDL-C检测的特异性。LDL-C通过酶法在同一样本杯中进行检测。所有试剂供应商均提供双试剂,可适用于绝大多数自动化生化分析仪。对均相法检测LDL-C的研究发现均相法的不精密度可达到NCEP要求的标准(≤4%),最低检出限为2 mg/L,检测线性可达4 100 mg/L^{[ 28, 29]}。均相法检测LDL-C是可行的,但其对低值LDL-C的特异性较差,且根据其检测结果进行分级与Friedewald计算法和BQ法分级结果一致性较差。但对于Ⅲ型高脂蛋白血症患者、非空腹状态患者和TG>4 000 mg/L的患者来说,均相法检测LDL-C的准确度优于Friedewald计算法。

虽然均相法检测LDL-C有很多优点,但其与用于制定临床指南的参考方法检测结果间的一致性仍需进一步验证。Miller等^{[ 30]}选取了正常人样本(无疾病组)和心血管疾病患者样本及其他可能干扰检测的样本(疾病组)对全球应用比较广泛的8种均相法直接测定LDL-C的商品化试剂(Denka Seiken、Kyowa、Sekisui、Serotec、Sysmex、UMA、Wako和Roche)的准确度、不精密度和特异性进行评估。这些试剂包含不同的能够阻断或激活血清脂蛋白中某些部分颗粒中胆固醇检测的表面活性剂、离子聚合物和其他化学组分。

8种均相法直接测定LDL-C的商品化试剂的不精密度、准确度和特异性等方面均存在一定差异。8种试剂对4个冻存血清池样本进行连续28周检测的不精密度结果显示,当试剂批号更换时Serotec公司(3.6%~7.5%)和UMA公司(-4.9%~-2.1%)试剂检测结果变化明显;当定标品批号更换时Sysmex公司试剂检测结果(-3.9%~3.3%)变化明显。同一血清池样本在检测顺序的前后差异也会影响检测结果,其检测结果均值变化自-0.4%~3.5%不等,且高值LDL-C样本变化明显。统计结果显示各试剂的不精密度(以总 CV表示)自1.4%(Kyowa公司)~3.7%(Serotec公司)不等,仅有一个血清池样本使用Serotec公司试剂检测时 CV为4.4%,超出了NCEP对LDL-C检测不精密度的要求(≤4%)。8种试剂检测结果和参考方法结果间的差异比较,结果显示非疾病组样本结果无明显差异(UMA公司试剂除外),而疾病组样本直接法检测结果与参考方法结果差异明显,且不匹配样本LDL-C多为低值(<2.5 mmol/L或100 mg/L)。Roche公司、Serotec公司和Sysmex公司试剂的检测结果与参考方法结果相比持续存在负偏倚。在非疾病组样本检测中,8种试剂中5种达到了NCEP的总误差要求(≤12%)。Denka公司、Roche公司和Sysmex公司可能由于不精密度和偏倚等原因,稍稍超出了NCEP的总误差要求。而在疾病组样本检测中所有8种试剂均未达到NCEP的总误差要求。Roche公司、Serotec公司和Sysmex公司试剂对疾病组和非疾病组样本检测的偏倚均超过了NCEP的要求(≤4%)^{[ 30]}。

不同脂蛋白中TG水平存在明显差异,这对脂蛋白临床检测和血脂疾病诊疗等都有明显影响^{[ 31]}。Miller等^{[ 30]}使用8种均相法试剂对不同TG含量的样本分析发现随着样本TG含量升高,均相法检测LDL-C结果与参考方法检测的结果间差异增加(除Serotec公司试剂外)。对于TG含量较低的样本,8种试剂中有7种存在明显负偏倚,其中Roche公司试剂检测结果的总误差超出NCEP的要求。样本TG水平与均相法检测LDL-C结果间并无直接相关性。

目前仍无研究表明均相法检测LDL-C的商品化试剂可完全达到NCEP的全部要求,各厂商试剂仍有待于进一步改良。

Tanno等^{[ 32]}选取了21 194名40~79岁的TG<4.52 mmol/L的正常个体,比较Friedewald计算法和均相法检测LDL-C结果间的差异,其中3 270名受试者为空腹状态。研究结果显示空腹状态受试者Friedewald计算法和均相法检测LDL-C结果间无差异,均值均为3.24 mmol/L。但根据受试者TG水平进一步分组(分别以1.69和 2.26 mmol/L为切点分为3组)后进行数据分析,结果显示TG正常组Friedewald计算法和均相法LDL-C检测结果间无明显差异,均值分别为3.23和3.22 mmol/L;TG水平中度和高度升高的2组受试者均相法检测LDL-C结果均明显高于Friedewald计算法,差异分别为0.04和0.06 mmol/L。非空腹状态受试者研究结果发现均相法检测LDL-C结果均明显高于Friedewald计算法,均值分别为3.08和3.01 mmol/L。TG正常的非空腹状态受试者2种方法间LDL-C结果均值也存在0.02 mmol/L的差异,而TG中度和高度升高的2组非空腹状态受试者2种方法间LDL-C结果均值差异则进一步分别扩大到 0.17和0.33 mmol/L。Cordova等^{[ 33]}对10 664名受试者的研究结果与Tanno等^{[ 32]}一致。

无论受试者是否空腹,Friedewald计算法和均相法检测LDL-C结果间存在很好的相关性。2种方法检测LDL-C结果的Pearson相关系数( r)分别为0.971(空腹状态受试者样本)和0.955(非空腹状态受试者样本)( P均<0.001)。TG水平对2种方法检测空腹状态受试者样本和非空腹状态受试者样本LDL-C结果差异的影响有所不同。对于空腹样本,2种方法间LDL-C结果差异与TG水平呈正相关( r=0 .157, P<0.001);TG水平每升高1.00 mmol/L,2种方法间LDL-C结果差异增加0.05 mmol/L。对于非空腹样本,2种方法间LDL-C结果差异与TG水平呈更强的正相关( r=0 .523, P<0.001);TG水平每升高1.00 mmol/L,2种方法间LDL-C结果差异增加0.17 mmol/L^{[ 32]}。Mora等^{[ 34]}对27 331名女性受试者的研究发现对于空腹状态样本,Friedewald计算法和均相法检测LDL-C结果间存在很好的相关性,与Tanno等^{[ 32]}的研究结果一致,而非空腹样本则一致性相对较差,与Tanno等^{[ 32]}的研究结果存在一定差异,这可能是由于受试者人群选择差异所导致的。

Tanno等^{[ 32]}对Friedewald计算法和均相法检测LDL-C结果用于NCEP风险分级的一致性进行分析,发现84.8%的空腹受试者分级结果一致,而15.2%的空腹受试者2种方法分级结果相差一级;80.1%的非空腹受试者分级结果一致,而19.8%的非空腹受试者2种方法分级结果相差一级。研究还发现随着TG水平的升高,根据均相法结果进行风险分级比Friedewald计算法分级结果高的受试者比例随之上升。对所有受试者进行Logistic回归分析发现,根据均相法和Friedewald计算法检测结果进行NCEP分级的不一致性与TG水平升高有相关性,TG水平升高1 mmol/L的比值比为2.44(95%可信区间为2.26~2.63)。此外,受试者患有糖尿病和样本为非空腹状态也与2种方法分级的不一致性有关。