多元醇途径广泛参与糖尿病血管病变,该通路由一系列酶系统构成,其中醛糖还原酶是关键酶。醛糖还原酶基因启动子的多态性与糖尿病足的血管病变密切相关。正常情况下葡萄糖很少通过此途径代谢,但糖尿病患者体内己糖激酶已呈饱和状态,此时多元醇通路被激活。多元醇代谢通路激活后使细胞内山梨醇和果糖过度堆积,进而引起细胞渗透性损伤,导致细胞内肌醇和谷胱甘肽水平下降,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid/ oxidized form of nicotinamide-adenine dinucleotid, NADH/NAD⁺)比值增高,钠钾泵活性下降,细胞和组织缺氧,最终导致内皮细胞受损^{[ 4]}。

晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)是在非酶促条件下蛋白质、氨基酸、脂质或核酸等的游离氨基与还原糖的羰基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后所产生的一组稳定的终末产物^{[ 4]}。正常人体内该反应进行缓慢,只生成少量AGEs,而高血糖状态时血浆和红细胞中的3-脱氧葡糖醛酮(3-deoxyglucosone,3-DG)处于高水平状态,而3-DG是生成AGEs的重要中间介质,因此糖尿病患者体内的AGEs呈加速合成状态^{[ 7]}。与AGEs结合的晚期糖基化终末产物受体(receptor for AGE, RAGE)在正常人内皮细胞等细胞中有低水平表达,但糖尿病患者的RAGE表达水平随其配体浓度的增加而上调^{[ 8]}。AGEs引起血管内皮细胞损伤的具体机制尚不完全清楚,可能包括以下几点:(1)通过诱导醛糖还原酶的激活参与多元醇途径;(2)促进PKC的活化,AGEs与RAGE结合后诱导细胞内甘油二酯的增加,促进胞内PKC的生成及活化^{[ 7]};(3)促进活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成,提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide -adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化剂的活性,诱发氧化应激;(4)直接与细胞外基质蛋白发生交联,改变基质蛋白的结构和功能^{[ 9]}。

PKC的激活可能是糖尿病血管病变的共同通路,高血糖状态下多种途径均可激活PKC,包括多元醇途径通过使NADH/NAD⁺比值升高利于二酯酰甘油(diacylglycerol, DAG)形成,从而激活PKC;氧化应激反应和游离脂肪酸增加均可激活PKC^{[ 10]};高血糖和AGE-RAGE系统均可使细胞内DAG增多,激活PKC。PKC激活后可抑制内皮细胞内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)活性,降低一氧化氮(nitric oxide, NO)产生,并增加血管内皮细胞内皮素(endothelin-1,ET-1)的释放,导致血管舒缩功能障碍,同时促使血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达,促进新生血管生成,增加血管通透性,改变毛细血管渗透压,使组织缺氧^{[ 11]}。

越来越多的研究表明,氧化应激反应是糖尿病各种并发症发生的共同通路和中心环节。而糖尿病患者体内增加的氧化应激反应水平是高血糖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症和血脂异常共同作用的结果,他们均可导致血管内皮细胞线粒体过氧化物的生成过度。此外,氧化应激还加速了糖尿病患者体内2种抗动脉粥样硬化关键酶的灭活:eNOS和前列环素合酶^{[ 12]}。氧化应激诱导内皮细胞损伤的机制非常复杂,Brownlee等^{[ 13]}认为糖尿病状态下高浓度的血糖水平抑制线粒体电子传递链,导致终末环节受抑,发生氧化应激反应而生成大量ROS 。细胞内增加的ROS水平导致机体对缺血的血管重建反应缺陷,并激活多种炎症反应,使糖尿病患者的血糖水平恢复正常后仍存在持续性炎症基因表达的长期表观遗传变化^{[ 5]}。在生理条件下,ROS可以调节细胞的功能,介导细胞受体信号转导和机体免疫应答,但当表达过度时,ROS通过渐进性调节血管炎性细胞的生长和迁移导致内皮细胞损伤,包括细胞外基质的改变、内皮细胞凋亡、激活转录因子、过度表达炎性细胞因子和黏附分子^{[ 14]}。ROS的可能作用机制有:(1)激活核因子(nuclear factor-kappa B, NF-κB),合成更多的eNOS,导致NO生成增多,而高浓度的超氧阴离子迅速与新生成的NO反应产生强氧化剂过氧亚硝基阴离子,进而引发脂质过氧化反应,导致内皮细胞损伤;(2)降低四氢叶酸的活性,导致eNOS解偶联;抑制二甲基精氨酸水解酶,使eNOS的竞争性抑制剂二甲基精氨酸相应增加,NO减少;(3)增加血管内皮细胞表面的黏附分子-1、间质细胞黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)的表达,导致白细胞与血管内皮细胞间黏附增加,聚集形成小栓子阻塞血管^{[ 3]} 。

血管内皮细胞是一种多功能细胞,可分泌多种生物活性物质。大量研究发现,NO、血浆内脂素、ET-1均与内皮细胞功能紊乱相关。

1. NO与内皮功能紊乱

NO作为内皮依赖性舒张因子,其生物利用度的降低和功能受损是引起内皮功能障碍的主要致病机制^{[ 6]}。Yilmaz等^{[ 15]}发现,糖尿病患者血糖控制欠佳、增高的醛糖还原酶以及长期存在的高糖毒性,AGE和葡萄糖氧化时产生的大量自由基等均促进了NO的灭活及活性异常,引起内皮依赖性血管舒张障碍。对内皮细胞的存活至关重要的一个环节是氧化应激调控NO的产生,高水平的氧化应激反应可引起NO浓度的下调。有研究表明血管内NO的生成,伴随超氧化物合成增加,导致强氧化剂过氧亚硝基阴离子浓度升高,从而降低NO的生物利用度^{[ 16]}。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)是决定NO含量的主要因素。Rogers等^{[ 17]}通过建立人脐静脉内皮细胞的体外模型发现高或低浓度的葡萄糖均可诱导 NOS基因表达失调,并可导致内皮细胞衰老标志物的提前出现,进而损伤内皮细胞功能。 NOS基因尤其是 eNOS基因的表达减少可能是导致内皮功能障碍的重要原因,Imamura等^{[ 18]}针对血管内皮功能评估了101名健康年轻男性的2种不同 eNOS基因T-786C和Glu298Asp的功能意义,发现 eNOS的T-786C多态性可能决定了脂肪组织中脂联素的表达浓度,而Glu298Asp多态性则可能与血脂水平和其他代谢危险因素相关,二者的作用均通过外周组织的血流量调节和氧化应激反应实现。这2种基因多态性的表型都与代谢综合征的临床特征相关,表明eNOS基因型和NO水平与机体代谢状况密切相关。有研究表明正常释放的NO灭活或NOS活性受损均可导致NO的活性降低^{[ 19]}。此外,血流动力学应激切变和低氧也可造成NOS表达下降,AGEs可诱导NO抵抗并抑制内皮细胞NOS的产生从而导致血管功能紊乱^{[ 20]}。目前认为正常水平的胰岛素对维持血管内皮功能起着关键作用,胰岛素能刺激血管内皮细胞释放NO,还可增强内皮细胞eNOS的表达从而增加NO生成,引起内皮依赖性舒张。但高浓度、长时间的胰岛素作用于内皮细胞,则可导致内皮细胞源性的NO生成减少,舒血管的物质减少,舒张功能障碍,引起内皮功能紊乱^{[ 21]}。

2. 内脂素与内皮功能紊乱

内脂素是一种新发现的由腹腔内脂肪组织分泌的脂肪细胞因子,具有类胰岛素活性,研究发现内脂素与胰岛素抵抗和肥胖密切相关^{[ 22]}。内脂素具有促进脂肪分化的聚集作用,并可调节糖脂代谢、免疫反应、炎症反应和心血管功能^{[ 23]}。Chang等^{[ 24]}进行的Meta分析建议,使用内脂素可以预测肥胖、糖尿病状态、胰岛素抵抗、代谢综合征和心血管疾病。Uslu等^{[ 22]}研究发现2型糖尿病患者体内内脂素水平升高,推测其可能机制有:(1)内脂素浓度增高导致靶组织中内脂素信号途径受损;(2)由于内脂素的类胰岛素效应,其水平升高可能是机体应对高血糖状态的补偿机制;(3)内脂素介导NAD生物合成,可调节葡萄糖刺激的胰岛素分泌,其水平升高可能是机体β细胞功能的一种代偿机制。有研究表明,胰岛素抵抗通过不同机制导致血管内皮NO合成及代谢发生障碍,而血浆内脂素可能与胰岛素抵抗上的非胰岛素的结合位点相结合,引起胰岛素抵抗构象变化,增加胰岛素敏感性^{[ 25]}。但另一方面,血浆内脂素通过抑制NOS导致内皮细胞功能障碍,使NO合成减少,同时也促进了糖尿病血管并发症的发生和发展。而血管内皮受损后组织严重缺氧也可促进血浆内脂素合成释放增多。此外,高血糖时的氧化应激也可促进血浆内脂素的高表达,血浆内脂素可与炎症因子相互作用,促使内皮细胞通透性增加导致血管病变。

3. ET-1生成增加与内皮功能紊乱

ET-1是由血管内皮细胞合成的细胞因子,是内皮功能障碍的标志物,在一定程度上参与氧化应激反应和内皮功能紊乱机制。ET-1作用于血管平滑肌细胞,通过其血管收缩和致有丝分裂作用参与了血管病变。血管内皮功能障碍的特点是内皮源性血管扩张和收缩物质的失衡,在糖尿病血管病变的发病机制中起着重要的作用^{[ 26]}。而ET-1作为一个强有力的血管收缩肽,其表达及活性作用促进了血管内皮功能障碍的发生^{[ 27]}。Feng等^{[ 28]}研究发现糖尿病患者对ET-1缩血管作用的敏感性下降,推测其作用机制可能包括激活ET-1 A型受体和活化PKC-α。研究证明糖尿病患者血管病变的水平与血浆ET-1呈正相关,除了其直接血管收缩作用外,增高的ET-1可能通过抑制NO的生成加速血管内皮功能障碍。此外,ET-1诱导机体对胰岛素的敏感性降低可能是代谢综合征发展过程中的一部分^{[ 26]}。ET-1还是细胞增殖剂,与其受体结合后可通过PKC途径产生对血管平滑肌细胞的促分裂增殖效应^{[ 29]}。实验证明内皮功能障碍患者体内ET-1水平明显增高,ET-1通过增加血管内皮细胞中ROS和活性氮簇的水平而发挥其病理作用,而ROS反过来也能增加ET-1的产生^{[ 26]}。因此,ROS和ET-1可能形成一个前反馈系统加剧了糖尿病患者的内皮功能损伤。

综上所述,糖尿病足内皮功能紊乱的发生和发展过程受到多种因素的影响。氧化应激反应、多元醇通路、AGE-RAGE系统、PKC信号通路的激活以及多种细胞因子相互交叉作用。其中,氧化应激反应是中心环节,PKC信号通路是所有机制的共同通路。AGE-RAGE系统、氧化应激反应与PKC信号通路三者相互激活,PKC信号通路在前二者及多元醇通路的共同激活作用下诱导多种细胞因子水平的改变,最终导致内皮细胞功能紊乱。虽然对糖尿病足内皮功能紊乱发病机制的研究取得了一定成果,但对这些机制的研究多局限于蛋白质和分子水平,而针对基因水平的探索还有待进一步阐明。