引用本文
靳宝英, 曾昭伟, 李会强. 妊娠相关血浆蛋白A酶联免疫诊断方法学研究. 2013, 28(10): 908-912[JIN Baoying, ZENG Zhaowei, LI Huiqiang. Study on the determination of pregnancy associated plasma protein A by ELISA. 上海检验医学, 2013, 28(10): 908-912]  
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妊娠相关血浆蛋白A酶联免疫诊断方法学研究
靳宝英1, 曾昭伟2, 李会强3
1. 天津市职业病防治院,天津 300011
2. 天津医科大学2009级,天津 300070
3. 天津医科大学检验学院,天津 300070

靳宝英,女,1968年生,副主任技师,主要人事医学检验工作。

李会强,联系电话:022-88822296。

基金:天津市科技计划项目(08ZCGYSF01800);
摘要
目的

建立供临床检测妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)的酶联免疫诊断方法。

方法

用足月孕妇血清通过分子筛以及离子交换层析纯化后制备抗体,进而制备生物素标记的PAPP-A以及酶标记抗体。按照常规的酶联免疫吸附试验(ELISA)操作步骤检测标本,观察本方法的敏感性、特异性、回收率、稳定性等指标。测定30份早孕患者血清与美国DRG公司试剂盒做对比。

结果

分子筛与离子交换层析纯化效果良好。标准曲线范围为1~50 μg/mL。敏感性为0.35 μg/mL,回收率均>100%,特异性、稳定性试验结果显示效果良好。本试验方法与美国DRG公司试剂盒检测结果高度相关,回归方程为:Y=2.286 1+1.026 9X(r=0.982,P<0.01)。

结论

PAPP-A抗体标记生物素后,利用生物素与亲和素的高度亲和力进行ELISA,该方法在PAPP-A的临床检测中有较大的实际意义。

关键词: 妊娠相关血浆蛋白A; 酶联免疫吸附试验; 方法学; 生物素; 亲和素
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)10-908-05
Study on the determination of pregnancy associated plasma protein A by ELISA
JIN Baoying1, ZENG Zhaowei2, LI Huiqiang3
1.TianjinPreventionandTreatmentCenterforOccupationalDiseases,Tianjin 300011,China
2.Grade 2009,TianjinMedicalUniversity,Tianjin 300070,China
3.DepartmentofLaboratoryMedicine,TianjinMedicalUniversity,Tianjin 300070,China
Fund:
Abstract
Objective

To establish a enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the diagnosis method of pregnancy associated plasma protein(PAPP-A).

Methods

Sera from full-term pregnant women were purified by molecular sieve and ion exchange chromatography,and then the biotin labeling PAPP-A and enzyme-labelled PAPP-A antibody were prepared. Traditional ELISA was used to detect the samples,and the sensitivity,specificity,recovery and stability were observed. The results of 30 samples from first trimester pregnant women were kit from DRG of USA.

Results

The result of the purification by molecular sieve and ion exchange chromatography was good. The range of standard curve was 1-50 μg/mL. The sensitivity was 0.35 μg/mL,the recovery was>100%,and the stability and specificity were good. The method had good correlation with the kit from DRG of USA,and the regression equation wasY=2.286 1+1.026 9X(r=0.982,P<0.01).

Conclusions

Biotin labeling PAPP-A is made, and the connection ability of biotin and avidin can be reflected in the ELISA. The ELISA is meaningful in the determination of PAPP-A.

Keyword: Pregnancy associated plasma protein A; Enzyme-linked immunosorbent assay; Methodology; Biotin; Avidin
引言

妊娠相关血浆蛋白A(pregnancy associated plasma protein A,PAPP-A)是1974年Lin等[ 1]从孕妇血清中分离出来的一种大分子糖蛋白化合物。由胎盘合体滋养层和蜕膜细胞产生[ 2],也存在于非孕妇的非胎盘组织中,甚至男性的体内也有PAPP-A的存在。目前PAPP-A应用于妊娠早期检测唐氏综合征[ 3]。本研究旨在通过从孕妇血清中分离纯化出PAPP-A抗原并以此制备抗体,进一步研究一种提升常规酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测敏感性、特异性的生物素-亲和素ELISA,使PAPP-A的临床应用更加广泛。

材料和方法
一、材料

1. 主要仪器

电热恒温培养箱购自天津市天宇实验仪器有限公司;HHS型电热恒温水浴锅购自天津市华北实验仪器有限公司;DNM9602酶标分析仪购自北京普朗新技术有限公司;AL104电子天平购自天津市天马仪器厂;磁力搅拌器购自天津市华北实验仪器有限公司;聚苯乙烯板购自美国COSTAR;梅特勒-托利多pH计、梅特勒-托利多分析天平购自天津市天马仪器厂;新西兰家兔购自中科院血液病研究所动物中心。

2. 主要试剂

辣根过氧化物酶购自美国GE公司;醋酸钠、高碘酸钠、硼氢化钠、牛血清白蛋白购自天津北方天医化学试剂厂;Proclin300购自SUPELCO公司;Tween 20 购自Sigma公司;氨基己酸、乙二醇、四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine,TMB)、生物素、链霉亲和素购自Sigma公司;Sephadex G-25购自瑞典Pharmacia公司;PAPP-A双抗体夹心法酶免检测试剂盒购自美国DRG公司。

二、方法

1. 孕妇血清分子筛层析纯化

采用2.6 cm×100.0 cm层析柱,Sephadex G-200为填料。透析处理的孕妇血清上样量为10 mL,洗脱液为磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)0.01 mol/L,流速为1.5 mL/min,紫外280 nm波长处测其吸光度( A)值,根据 A值变化收集洗脱液体,经ELISA检测蛋白质活性以判定PAPP-A活性蛋白峰。

2. 孕妇血清离子交换层析纯化

采用2.6 cm×40.0 cm层析柱,DEAE A-50为填料。以pH值7.2的0.01 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸冲洗所装层析柱,待出水口与入水口液体电导相同后,将上述分子筛层析处理的孕妇血清收集液上样,梯度洗脱(NaCl浓度依次为0.15、0.3和0.45 mol/L),收集洗脱液,紫外280 nm波长处测其 A值。经ELISA检测蛋白质活性以判定PAPP-A活性蛋白峰。

3. 抗体的制备

纯化得到的PAPP-A抗原与等体积的完全弗氏佐剂充分混合,家兔皮内注射10个点。每间隔2周加强注射1次,抗原量不变,与等体积的不完全弗氏佐剂充分混匀,皮内注射。如此重复3次。最后加强1次,3 d后耳静脉取血1 mL,12 g/L的双向琼脂扩散测定效价。效价达标后,耳静脉取血,1次取血20 mL,间隔2 d再行同样方法取血。

4. 辣根过氧化物酶标记PAPP-A抗体

酶与NaIO4反应后过Sephadex G-25除盐。处理的酶与透析后抗体室温避光搅拌反应1 h,再加入4 mg/mL的NaHB4,室温避光搅拌1 h。制备的反应物对 0.01 mol/L PBS/Proclin300溶液透析,装入Sephadex G-200凝胶层析柱,用0.01 mol/L PBS溶液冲洗。所需的酶体积为:V=0.502×4/1.38×2.5×3/2.7= 4.04 mL。4为抗体的稀释倍数,1.38为IgG在280 nm处的吸光系数,3为酶与抗体的质量比。根据以下公式计算:

酶量(g/L)= A403×0.4

抗体(g/L)=( A280 -A403×0.34)×0.62

物质量的比值=酶量/抗体×4

5. 生物素标记PAPP-A抗体

将生物素与N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide, DMF)室温搅拌反应,产物与在0.1 mol/L的碳酸盐溶液(pH值9.5)中充分透析的PAPP-A室温反应1 h。生物素化抗体在4 ℃下用0.1 mol/L pH值7.4的PBS溶液透析24 h。

6. 反应操作步骤

按照常规ELISA进行,抗原采用已配制好的PAPP-A系列标准品,其浓度经过所购美国DRG公司PAPP-A酶免试剂盒测定。将不同稀释比例的生物素标记抗体和不同稀释比例的酶标抗体进行组合,试验后通过标准曲线形状,并保证强阳性的抗原标准品的 A值在1 .9左右,空白孔的 A值<0.1。

7. 方法学评价

(1)标准曲线的确立:以美国DRG公司PAPP-A酶免试剂盒检测结果为准,将高浓度PAPP-A抗原用标准品稀释液稀释为0、1、2.5、5、10、25、50、100和200 μg/mL的浓度,平行管操作,得出标准曲线的范围;(2)敏感性:对0 μg/mL标准品进行10次重复测定,计算其 A值的 和 SD,用标准曲线反算出其 +2 SD对应的浓度值,即为本试剂盒的敏感性[ 4];(3)准确性:采用回收试验测定。向2份已知不同浓度标准血清中分别加入2份不同浓度的临床血清标本,测定其PAPP-A含量,计算回收率。回收率=(测定值-原PAPP-A浓度)/加入PAPP-A浓度×100%;(4) 稳定性:将试剂盒放置37 ℃温箱,分别于第0、3、5、7天取出,进行检测,通过标准曲线变化观察其稳定性;(5)精密度:用3份妊娠足月孕妇血清配制成低、中、高浓度质控血清,每个质控血清平行做10孔,在同一块酶标板中测定他们的浓度,计算批内变异系数(coefficient of variation, CV);采用相同方法分别于不同酶标板中测定他们的浓度,计算批间差异,观测其精密度。 CV=SD/ ×100%;(6)特异性:配制1 μg/mL PAPP-A标准品,测定其 A值,作为对照。同样,于标准品稀释液中分别加入人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,β-HCG)、催乳素(prolactin,PRL)、甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、雌二醇(estradiol,E2)等,观察各物质达到同样 A值的加入量,计算交叉反应率(交叉反应率=各物质加入量/PAPP-A量×100%);(7)2种方法测定结果的比较:分别采用所建立方法和美国DRG公司试剂盒对30 份早孕血清进行检查,采用相关性分析对2种检测方法的测定结果进行比较,以观察这2种方法是否有差异,若2种方法无差异,说明相关性较好。

三、统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行处理。2种检测方法的相关性分析采用直线相关,计算线性回归方程的斜率、截距和相关系数。相关系数的检验以 α=0.05为检验水准。

结果
一、分子筛层析纯化

孕妇血清通过分子筛凝胶层析纯化,经过活性测定可知,PAPP-A主要存在于第1个峰形。见图1:

图1 PAPP-A分子筛层析纯化图谱

二、离子交换层析纯化

孕妇血清通过离子交换层析纯化,经过活性测定可知,PAPP-A主要存在于最后一个峰形。见图2:

图2 PAPP-A离子交换层析纯化图谱

三、制备酶标抗体

将透析后的酶结合物上样,取第1个峰,体积为6 mL。见图3:

图3 辣根过氧化物酶标记抗体纯化图谱

用紫外分光光度计测280 nm处的 A值, A280值为0.502。

经紫外可见分光光度计检测, A403值为2 .25, A280值为1.27,经计算,抗体为0.31 g/L,酶量为0.9 g/L,物质量的比值为1.37。

四、标准曲线的确立

A值与PAPP-A浓度的关系显示,在1~50 μg/mL范围内有较好的线性,见图4,线性相关系数( r2)=0.999,见图5,因此,标准曲线范围确定在1~50 μg/mL之间。

图4 PAPP-A线性范围

1. 敏感性

用标准曲线反算出0 μg/mL A值的 +2 SD对应的浓度值,得出该方法的敏感性为0.35 μg/mL。

图5 PAPP-A标准曲线五、方法学评价

2. 准确性

回收试验结果显示其回收率均>100%,说明此方法具有很好的准确性,见表1:

表1 不同浓度标本的回收率

3. 稳定性

稳定性试验显示,在37 ℃温箱中放置3 d与0 d无明显变化,5 d后标准品 A值均有所下降,但线性良好,不影响测定,说明试剂盒的稳定性良好。放置7 d后,最大 A值较低,且线性较差。见图6:

图6 试剂盒稳定性

4. 精密度

低浓度检测结果的 CV值不大于10%,高浓度和中浓度检测结果的 CV值在10%左右,说明试验方法具有良好的重复性。见表2:

表2 不同浓度血清的批内和批间变异

5. 特异性

用本方法检测β-HCG、PRL、AFP、E2达到1 μg/mL的PAPP-A相同 A值所需加入量,结果各交叉反应率均<3.0%。

6. 2种方法测定结果的比较

2 种方法测定30 份标本,以美国DRG公司试剂盒所测得PAPP-A浓度为 X轴,本方法测定浓度为 Y轴,绘制散点图。对2种方法进行相关性分析回归方程为 Y=2.286 1+1.026 9X。(r=0.982,P<0.01)。

讨论

ELISA自1971年[ 5]问世以来,以其敏感性高,特异性强,操作简便、安全,不污染环境而广泛应用于临床诊断,是目前应用最广的酶免疫技术。由于抗原抗体反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性和稳定性。同时此技术是建立在抗原抗体反应和酶的高效催化作用的基础上,故而该技术具有检测敏感性高、特异性强、准确性好等特点[ 6]。其检测敏感性可达10-9 g/mL。近年来随着方法的不断改进,其敏感性有了更大的提高,因为其操作简便,无需昂贵仪器,易在基层医疗机构推广使用[ 7]。

由于目前国内用于唐氏综合征、冠脉综合征等PAPP-A相关疾病的PAPP-A测定试剂盒多数依靠国外进口,价格昂贵,大大加重了患者负担,限制了临床应用,因此,我们建立了PAPP-A间接包被微孔板ELISA,降低检测成本,便于临床推广使用。

辣根过氧化物酶由于其比活性高,稳定,相对分子质量小,纯酶容易制备,所以是目前免疫酶技术中常用的酶;常用的辣根过氧化物酶标记抗体的方法为改良过碘酸钠法[ 8],该方法所获酶标抗体的产率较高,且酶与抗体的活性无重大损失。本研究运用此法进行辣根过氧化物酶与抗PAPP-A抗体结合,经Sephadex G-200将游离的辣根过氧化物酶、抗体与反应完全的复合物分离,纯化得到酶与抗体结合物。

生物素易与生物大分子结合,再和生物素衍生物结合,将信号多级放大,提高检测敏感性,Smith[ 9]利用间接桥-亲和素-生物素标记法检测乙型肝炎表面抗原,其敏感性比常规ELISA高1 000多倍。抗体分子上的氨基基团极易被活化生物素即生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺酰化,使一个抗体分子连接上多个生物素分子。

本研究成功通过一系列的分子筛层析法以及离子交换层析纯化得到PAPP-A抗原并且成功免疫家兔制备PAPP-A抗体。在此基础上,本研究将抗PAPP-A抗体标记生物素,同时将生物素化牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)预先包被微孔板,利用生物素与亲和素的高度亲和力包被亲和素,进而将生物素化抗体间接固相化。通过生物素化BSA-链霉亲和素包被微孔板,采用针对同一抗原的2种不同的克隆抗体分别标记生物素和辣根过氧化物酶。首先加入生物素化抗体和抗原,反应后洗板,再加入酶标二抗,当标本中含有相应抗原时,会形成亲和素-生物素化抗体-抗原-酶标抗体复合物。反应时,未结合的物质通过洗涤去除。加入底物显色,以630 nm作为参考波长,测定450 nm处的 A值,通过绘制标准曲线求出标本中待测抗原浓度。

由于目前试验条件的限制,考虑到试验成本、推广可行性等问题,我们仍采用最常用的酶联免疫检测法。目前国内外用于检测PAPP-A的方法均采用多克隆抗体,特异性不强,实际上他们是抗PAPP-A/proMBP抗体,这些抗体是从以PAPP-A/proMBP复合物形式存在的血清中分离获得的抗原制备的,而在整个妊娠过程中,血清proMBP的水平大大超过了PAPP-A。为了使PAPP-A测定结果真实反映其在血液中的水平,尽可能提高检测的准确性,要求这种免疫分析应该是特异性针对PAPP-A的检测。Qin等[ 10]开发了一种双重单克隆抗体荧光免疫分析法,首次报道了这种分析方法能够特异性检测PAPP-A/proMBP复合体。本课题亦采用双重单克隆抗体酶联免疫检测法,避免了多克隆抗体的交叉反应,同时引入生物素-亲和素放大系统。

对该方法进行评价,敏感性为0.35 μg/mL,回收率均>100%;线性、稳定性及特异性良好;3份低、中、高浓度的血清标本重复测定10次,批内 CV值均不大于10%,批间 CV值均不大于15%;与国外同类方法进行相关性分析, r=0.982,提示2种检测方法高度相关。该方法可望替代同类进口试剂盒进行PAPP-A含量测定,联合β-HCG检测及超声胎儿颈半透明度测量用于孕早期唐氏综合征的筛查;同时,作为易损斑块有价值的标志物,该方法对PAPP-A的测定可望对急性冠脉综合征[ 11]患者的危险度分层提供有效的帮助。应用前景广阔。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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