引用本文
刘旭. 血管活性肠肽对缺血再灌注损伤大鼠脑内GFAP的影响. 2013, 28(9): 841-844[LIU Xu. Effects of vasoactive intestinal peptide to the activation of GFAP after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats. 上海检验医学, 2013, 28(9): 841-844]  
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血管活性肠肽对缺血再灌注损伤大鼠脑内GFAP的影响
刘旭
天津中医药大学第一附属医院检验科,天津 300193
摘要
目的

通过活体实验研究血管活性肠肽(VIP)对脑缺血再灌注后胶质纤维酸性蛋白(GFAP)动态变化的影响及星型胶质细胞活化增殖的情况,探讨VIP的神经保护作用。

方法

大鼠注射VIP后,用线栓法制作大鼠大脑中动脉再灌注(MCAO)模型。通过神经学评价对MCAO大鼠进行判定和筛选;应用免疫组化技术检测脑缺血区GFAP表达。

结果

VIP注射后与对照组相比GFAP表达显著增加(P<0.05),在相同缺血区的星形胶质细胞反应上调增强。

结论

VIP脑内注射可明显增强GFAP的表达,降低再灌注损伤程度;提示VIP可能具有体外神经保护作用。

关键词: 胶质纤维酸性蛋白; 血管活性肠肽; 脑缺血再灌注; 星型胶质细胞
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)09-0841-04
Effects of vasoactive intestinal peptide to the activation of GFAP after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats
LIU Xu
Department of Clinical Loboratory, the First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China
Abstract
Objective

To investigate the effects of vasoactive intestinal peptide(VIP) on the dynamic changes of glial fibrillary acidic protein(GFAP) after focal cerebral ischemia-reperfusion in vivo and the proliferation of astrocyte, and discuss the neuroprotective effects of VIP.

Methods

In rats, VIP was given via injection, and middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was set up by suture method. The evaluation and screening of rats with successful occlusion of MCAO were performed by neurological testing. The expression of GFAP was detected by immunohistochemistry.

Results

Compared with the control groups after VIP injection, GFAP expression significantly increased(P<0.05). The existing astrocyte response in the same ischemic area was upregulated.

Conclusions

VIP injection enhances the expression of GFAP and reduces the degree of cerebral ischemia-reperfusion injury. This study provides the evidence for the neuroprotective effects of VIP in vivo.

Keyword: Glial fibrillary acidic protein; Vasoactive intestinal peptide; Cerebral ischemia-reperfusion; Astrocyte
引言

脑组织局部过度的炎症反应是造成再灌注损伤的主要原因之一;而炎症反应核心是细胞黏附分子介导的级联反应导致细胞损伤,并促进继发性神经元损伤[1]。急性脑缺血再灌注损伤是非常复杂的病理生理过程,许多环节尚未阐明。进一步深入了解脑缺血的机制,探究更为有效的治疗方法和药物已经成为医学界面临的重要问题。血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)属于促胰液素-胰高血糖素-血管活性肠肽家族的成员。体外实验显示VIP能提高培养的星形胶质细胞摄取谷氨酸的能力,促进胶质源性营养物质的释放,参与保护神经元[2]。既往研究表明,局灶性成年大鼠脑缺血损伤后脑内均有明显的神经再生现象,而星形胶质细胞在脑缺血中的作用日益受到关注。脑缺血后星形胶质细胞可能通过分泌生长因子、细胞因子、识别分子等修复损伤的神经元、促进神经轴突再生及诱导再生神经元的迁移,从而有利神经系统正常功能的恢复[3,4]。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是脑间质纤维的主要亚单位,是星形胶质细胞的一种标志蛋白。因此,通过活体研究观察脑内注射VIP后对暂时性局部脑缺血再灌注大鼠GFAP的影响,探讨VIP在脑缺血再灌注损伤后对神经元保护可能的作用。

材料和方法
一、实验动物

选用体重240~280 g的健康Wistar雄性大鼠,由北京军事医学科学院实验动物中心提供。安静环境饲养,室温25 ℃左右,自由进食饮水。根据缺血再灌注后时间的不同随机分为缺血再灌注3、6、12、24和48 h 5个时间点,每个时间点又分为VIP组(注射VIP伴脑缺血再灌注)和对照组(非注射VIP伴脑缺血再灌注)。

二、药物实施

大鼠经水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于脑立体定位仪,选择右侧脑室[以前囟(Breg-ma点)为0点,向后1.0 mm,旁开1.4 mm,深3.5 mm]为注射区,VIP组注射VIP(0.25 g/L)溶液2 μL,留针10 min,缝合皮肤。对照组用等容量生理盐水做同样处理。

三、缺血模型的建立

VIP脑内注射后即刻参考Longa等描述的管腔内线栓技术闭塞右侧大脑中动脉(middle cerebral artery occlusion,MCAO)诱导建立暂时性局部脑缺血大鼠模型。大鼠做颈部前正中切口,分离暴露右侧颈部血管,用微动脉夹暂时夹闭颈内动脉,结扎颈总动脉和颈外动脉。将头端加热呈光滑椭圆球形的3-0单股尼龙线经颈外动脉缓慢插入颈内动脉至感到有轻微阻力为止,进线长约18 mm左右。

四、神经学的评价

大鼠MCAO后2 h参照Bederson等方法进行神经功能损伤程度的评定,即0级:行为正常;1级:提尾悬空左侧前肢屈曲,肩内收;2级:抵抗对侧推力下降,伴前肢屈曲;3级:自发性侧向旋转或运动,伴抵抗对侧推力下降和前肢屈曲。评定为3级者被视为成功脑缺血模型并进行进一步的实验。

五、GFAP检测

将固定的脑组织以0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS,pH值7.4)冲洗,将从视交叉至脑桥前缘冠状位切取脑组织,OCT包埋,冰冻切片机连续冠状切片,厚度为20 μm,贴在用多聚赖氨酸处理过的载玻片上用于免疫组化染色。冰冻切片室温干燥1 h,冲洗后滴加酶修复液,并进行非特异性IgG的封闭和阻断;滴加适当稀释比例第一抗体4 ℃孵育过夜。分别滴加各种特异性生物标记抗体,冲洗后避光显色5 min或更长时间,至显色,自来水中终止反应。

六、统计学方法

所有数据均以 ±s表示,并采用SPSS 11.0统计软件分析,均数比较采用 t检验。 P<0.05为差异有统计学意义。

结果

脑缺血再灌注后VIP组及对照组GFAP表达见表1:

表1 脑缺血再灌注后不同时间点VIP组和对照组GFAP蛋白的表达

VIP组和对照组脑缺血再灌注48 h染色见图1、2:

图1 对照组脑缺血再灌注48 h免疫组化染色GFAP阳性细胞(×100)

图2 VIP组脑缺血再灌注48 h免疫组化染色GFAP阳性细胞(×100)

脑缺血再灌注3 h星型胶质细胞表达增加,至再灌注48 h随时间延长表达持续增高;且每个再灌注时间点VIP组星型胶质细胞数目及积分光密度值均高于对照组( P<0.05)。对照组星型胶质细胞胞体小、突起细、数量少;VIP组在细胞数量增加的同时,体积增大,突起多而粗大,GFAP阳性反应加深。

讨论

脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理过程,包括缺血期的原发性损伤和再灌注期的继发性损伤,其始动因素是脑组织缺血缺氧,但再灌注后所造成的损伤不仅于此[5]。脑星形胶质细胞是中枢神经系统(CNS)内在数目占绝对优势的一类大胶质细胞,被认为在神经元的整个发育过程中起重要作用[6]。星形胶质细胞参与中枢神经系统内神经元功能的调节,在维持神经元的生存微环境中起着重要的作用。缺血性脑损伤后星形胶质细胞增生并产生许多生物活性物质,对缺血损伤神经元具有保护作用;而过度的增生却可作为机械屏障影响髓鞘和轴索的再生,从而影响周围神经组织的结构修复和功能恢复。在脑缺血等病理情况下,星形胶质细胞在神经系统可塑性变化方面可发挥重要作用,其通过兴奋性氨基酸释放和重摄取、自由基清除等多途径影响神经元的存活[7]。

GFAP是星形胶质细胞中间丝蛋白的主要成分之一。当细胞受到刺激时,GFAP的表达将发生变化。而建立一个可重复的、稳定可靠的动物模型是研究脑缺血神经保护作用及其机制所必需的。本研究在对大鼠种系、体重和体温严格控制下,采用神经功能缺陷评分作为模型成功的判定标准,结果显示出现自发旋转或偏向左边运动的大鼠(3级)都同时伴有左侧前肢屈曲、肩内收以及左侧面的推抵抗力减弱。因此,MCAO后2 h进行神经功能缺陷评分,以评分为3级作为模型成功的判定标准是较为可靠的。本研究选取了脑缺血再灌注3、6、12、24和48 h 5个时间点对比观察 VIP组和对照组GFAP的变化。有研究证实[8]脑缺血再灌注后12~24 h黏附分子核酸及蛋白表达至峰值,而VIP对其表达峰值表达前后的整体影响正是对本研究有价值的实验数据。

VIP具有多种生物学功能。自VIP被发现以来,其对神经系统的保护和营养作用不断为人们所认识,在体外被广泛研究。VIP能增强与神经元共同培养的星形胶质细胞摄取谷氨酸的能力,消减谷氨酸介导的神经元的一氧化氮合酶(NOS)变构激活,从而减少NO产生[9,10],对抗谷氨酸诱导的细胞死亡。星形胶质细胞是中枢神经系统主要的大胶质细胞,对神经元起支持、保护、分隔、清洁和营养等作用;不仅在脑的发育和正常功能中起重要作用,也参与许多疾病的病理过程,是几种炎性因子和其他病理应激作用的靶细胞[11]。脑缺血后,可诱导星形胶质细胞发生反应,其反应包括2个阶段;第1阶段短暂,在缺血后20 min~24 h内,这时的星形胶质细胞呈正常血浆IgG阳性反应;第2阶段的反应与神经元变性有关,这时活化的星形胶质细胞在组织学上的特征表现为细胞肥大和增生,其生化标志则是星形胶质细胞GFAP阳性反应。由于在星形胶质细胞中有丰富和唯一的表达,故GFAP为活化星形胶质细胞的特异性标志物,可作为研究脑损伤后胶质反应的标志。中枢神经系统损伤后的星形胶质细胞反应表现为早期星形胶质细胞功能的紊乱在缺血性脑损伤中具有重要作用[12];而在缺血性脑损伤后期,反应性星形胶质细胞GFAP的表达明显增多,说明星形胶质细胞在后期缺血性脑损伤的脑组织修复中有重要作用[13]。本研究表明,对照组脑缺血再灌注3、6 h时GFAP轻度表达,而在脑缺血再灌注12、24 h,脑组织GFAP表达明显增强,再灌注48 h其表达进一步增高。这提示在脑缺血再灌注后星形胶质细胞增生活化。VIP组与对照组相比在各时间点表达均加强( P<0.05),可见VIP注射后GFAP表达明显加强,而GFAP增加意味着星形胶质细胞的活化,也增强了清除兴奋性神经递质和离子包括谷氨酸、H+、K+及自由基等的能力,有利于重建神经元的完整性,修复神经功能。证明VIP促进了星形胶质细胞的活化,对神经元的保护具有积极的作用。

总之,在缺血性脑血管疾病尚无有效治疗方法的今天,深入研究VIP与脑缺血再灌注损伤的神经元保护机制的关系,可能会为脑血管疾病的综合治疗提供有益的探索方向。

The authors have declared that no competing interests exist.

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