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顾萍, 王静, 张帆, 姚如恩, 傅启华. 血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa基因多态性与血小板输注疗效的关系. 2013, 28(9): 770-774[GU Ping, WANG Jing, ZHANG Fan, YAO Ruen, FU Qihua. The relationship between gene polymorphism of platelet glycoprotein Ⅱb/Ⅲa and therapeutic effect of platelet transfusion. 上海检验医学, 2013, 28(9): 770-774]  
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血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa基因多态性与血小板输注疗效的关系
顾萍, 王静, 张帆, 姚如恩, 傅启华
上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科,上海 200127
摘要
目的

通过对98例患者血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa基因多态性及血小板抗体的检测,探讨其与血小板输注疗效的关系。

方法

采用聚合酶链反应(PCR)扩增结合测序的方法检测患者GPⅡb/Ⅲa基因中5个外显子的9个多态性位点,采用固相凝集法检测患者血小板抗体。

结果

98例患者中只检测到GP Ⅱb基因的第26外显子存在T18809G变异,导致Ile843Ser多态性,产生HPA-3aa/ab/bb血型的3种基因型。此3种基因型均与血小板抗体产生相关,造成血小板输注无效。98例患者的血小板抗体阳性率为52.0%,1 468袋血小板输注总有效率为77.8%,其中 65袋配合性血小板输注的有效率为83.1%。3种基因型之间均无明显差异。

结论

血小板特异性及相关性抗体的存在是造成血小板输注无效的主要免疫性因素,GP Ⅱb基因上的HPA-3多态性与血小板输注无效有关。

关键词: 血小板抗原; 血小板膜糖蛋白; 整合素αⅡbβ3; 血小板输注无效; 基因多态性
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)09-0770-05
The relationship between gene polymorphism of platelet glycoprotein Ⅱb/Ⅲa and therapeutic effect of platelet transfusion
GU Ping, WANG Jing, ZHANG Fan, YAO Ruen, FU Qihua
Department of Clinical Laboratory,Shanghai Children's Medical Center,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200127,China
Abstract
Objective

To investigate the relationship between gene polymorphism and therapeutic effect of platelet transfusion by detecting the gene polymorphism of platelet glycoprotein(GP) Ⅱb/Ⅲa and platelet antibody in 98 patients.

Methods

A total of 9 sites of 5 exons in GP Ⅱb/Ⅲa gene were amplified by polymerase chain reaction(PCR),and PCR products were directly sequenced to analyze the gene polymorphism. Platelet antibody was detected by solid phase agglutination assay.

Results

Only T18809G variation existing in Exon 26 of GP Ⅱb gene was found in 98 patients,which causing Ile843Ser polymorphism and producing HPA-3aa/ab/bb genotypes. All of the 3 genotypes can cause platelet antibodies,resulting platelet transfusion refractoriness. The positive rate of platelet antibody in 98 patients was 52.0%, the total effective rate of 1 468 platelet transfusion was 77.8%,and the effective rate of 65 matched platelet transfusion was 83.1%. There were no significant differences among the 3 genotypes.

Conclusions

The specificity and associated platelet antibody are the main immune factors for causing platelet transfusion refractoriness, and HPA-3 polymorphism in GP Ⅱb gene is associated with platelet transfusion refractoriness.

Keyword: Platelet antigen; Platelet glycoprotein; Integrin αⅡbβ3; Platelet transfusion refractoriness; Gene polymorphism
引言

血小板膜糖蛋白(GP) Ⅱb/Ⅲa,又称整合素αⅡbβ3,是血小板(PLT)膜上含量最多的膜糖蛋白,通常以复合物形式分布于PLT和巨核细胞表面,是PLT膜的主要受体。GPⅡb/Ⅲa基因的多态性构成不同的PLT血型,是造成PLT输注无效的免疫性因素。

材料和方法
一、对象

98例单采PLT输注患者均来自上海儿童医学中心血液肿瘤科,2010年8月至2011年10月的血液病治疗期间共输注单采PLT 1 468袋,均为输注单采PLT 3次以上且历时半年以上。其中男59例,女39例,年龄5个月~16岁。患者来源为全国各地,江苏、浙江、上海地区占大多数。对照组30例,均为非血液病患者,因PLT减少或术中输注单采PLT 2次以下。

二、方法

1. 标本采集

采集患者静脉血标本,以0.109 mol/L柠檬酸钠1∶9抗凝。标本为分2份,1份用于PLT抗体检测,分离血浆于-20 ℃冻存,1周内检测完毕;另1份用于抽提DNA,-80 ℃冻存。

2. 单采PLT来源

单采PLT由上海市血液中心提供。使用Haemonetics MCS+全自动血液成份分离机采集健康献血者PLT。每单位PLT容量约250 mL,含PLT约2.5×1011个。

3. 试剂与仪器

TIANamp Blood DNA Kit试剂盒由北京天根生化科技有限公司生产。引物设计参照NCBI GenBank中GPⅡb/Ⅲa基因(ITGA2B和ITGB)序列(序列号NG008331),由上海英骏生物技术有限公司合成,引物序列见表1:

表1 GP Ⅱb/Ⅲa上的PLT抗原扩增引物序列

聚合酶链反应(PCR)扩增试剂由TaKaRa公司(大连宝生物)生产。PLT抗体检测试剂盒(固相凝集法)及专用离心机由长春博德生物技术有限责任公司生产。PLT计数采用SYSMEX XS-800i全自动血液分析仪,配套试剂、校准品及质控品等均由Sysmex公司生产。

4. GP Ⅱb/Ⅲa基因多态性检测

按试剂盒说明书要求,提取患者基因组DNA进行PCR扩增反应。反应总体积25 μL,包括患者DNA 1 μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL、10×缓冲液2.5 μL、dNTP(10 mmol/L)2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、H2O 17.25 μL。扩增条件:95 ℃ 5 min,然后95 ℃变性30 s,56~62 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30个循环后,72 ℃10 min。PCR产物经虾碱酶(上海申能博彩生物科技有限公司产品)纯化后直接测序,所用仪器型号为ABI 3730 DNA测序仪。

5. PLT特异性及相关性抗体检测

按试剂盒说明书采用固相凝集法检测患者血浆中IgG型PLT抗体。

6. PLT输注指征

患者PLT减少,有颅内出血、体表有出血点、紫癜、鼻衄、龈血、血尿、消化道出血等出血症状或/和PLT计数<20×109/L伴或不伴出血症状。

7. PLT输注疗效评价

本研究采用输注后24 h PLT计数纠正增加指数(corrected count increment,CCI)作为评判依据。CCI=绝对增加数×体表面积/输入PLT总数。输注后24 h CCI>4.5为输注有效,否则为输注无效。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0软件统计。采用卡方检验进行数据分析。 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、GP Ⅱb/Ⅲa基因多态性检测结果

对所有患者的GP Ⅱb的E26和GP Ⅲa的E3、E4、E10、E12外显子进行测序分析,并与Genbank(序列号NG008331)相比对,结果除GP Ⅱb的E26存在T18809G的变异外,其他外显子未发现变异。T18809G变异导致Ⅱb基因编码843位的异亮氨酸为丝氨酸所取代,产生I843S(Ile843Ser)多态性。此多态性形成了PLT特异性抗原(human platelet antigen, HPA)-3血型的3种基因型,即HPA-3aa、HPA-3ab、HPA-3bb(图1):

图1 HPA-3基因多态性产生的3种血小板血型

注:(a)HPA-3aa,箭头所示为Ⅱb Exon26的T18809纯合子;(b)HPA-3ab,箭头所示为Ⅱb Exon26的18809T>G杂合变异;(c)HPA-3bb,箭头所示为Ⅱb Exon26的18809T>G纯合变异

3种基因型的例数分别为31、46、21例。

二、PLT特异性及相关性抗体检测结果

PLT抗体包括由PLT HPA产生的PLT特异性抗体和由HLA、红细胞抗原等共同抗原产生的相关性抗体。患者组PLT抗体阳性率为52.0%,明显高于对照组(13.3%, P<0.01),见表2:

表2 PLT抗体检测结果

说明PLT抗体在多次输注PLT的血液科患者中明显升高。3种HPA-3基因型之间PLT抗体阳性率无差异( P>0.05),说明HPA-3 3种基因型患者在多次输注PLT后都会产生PLT抗体,相互间无区别。见表3:

表3 3种HPA基因型产生PLT抗体的比较
三、PLT输注效果评价

1 468袋PLT中有1 142袋输注后24 h CCI>4.5,有效率为77.8%。PLT输注的有效性在HPA-3的3个基因型中无明显差异( P>0.05),其中HPA-3ab略高,见表4:

表4 PLT输注疗效在HPA-3基因型中的比较

对51例存在PLT抗体的患者中的21例做了PLT配合性输注,共输注单采PLT 65袋,有效输注54次,有效率为83.1%。

讨论

PLT GP Ⅱb/Ⅲa复合物是由α和β以非共价键结合而组成的异二聚体蛋白,其编码基因ITGA2B和ITGB3均位于染色体17q21~22上,以常染色体双等位基因以共显性模式控制。GP Ⅱb基因(ITGA2B)长17.2 Kb,含30个外显子,编码1 039个氨基酸。GP Ⅲa基因(ITGB3)长度为46 Kb,属于单拷贝基因,含15个外显子,编码778个氨基酸。GP Ⅱb和GP Ⅲa上均有很高的多态性,除HPA-14w外,绝大多数是由相应PLT GP结构基因中的单核苷酸多态性(SNP)引起,其多态性构成了人类PLT HPA,并表现为PLT独特的遗传多态性。

GP Ⅱb的第26外显子上存在I843S和V837M 2个多态性,分别构成HPA-3和HPA-9血型。GP Ⅲa的第3、4、10、12外显子上存在L33P、R143Q、R489Q、P407A、R636C、R62Q、R663H多态性,构成HPA-1、HPA-4、HPA-6、HPA-7、HPA-8、HPA-10和HPA-11共7个血型。

本研究通过对98例长期输注PLT的血液病患者GP Ⅱb和GP Ⅲa的9个多态性位点的检测,发现GP Ⅱb上存在I 843S多态性,即HPA-3aa、HPA-3ab和HPA-3bb 3个基因型,其余多态性未检出。迄今为止,已有多篇文献[ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]报道了不同国家、不同地区、不同人群的HPA基因检测频率存在差异。我国汉族人群的HPA多态性大多集中在HPA-1~6和HPA-15上,特别是HPA-3和HPA-15,该二者的a、b等位基因频率几乎各占一半,其a/b抗原不配合几率越高,在PLT输注时刺激受者免疫系统产生PLT抗体的几率就越大,HPA-3尤为严重。本研究结果显示,98例患者HPA-3的基因频率趋势与报道类似,因是收治的血液病患者而非普通人群调查,所以只能显示大体趋势。本研究未检出多态性的HPA-4、7、8、9、10、11的aa型频率在江苏、浙江、上海地区汉族人群中均为100%[ 6],HPA-1、6的aa型频率均>98%。本研究的标本量相对较小,是未能检出多态性的原因。

GP Ⅱb/Ⅲa基因多态性导致分子结构的空间构象发生改变,改变了其抗原性,调节了其表达水平,表面抗原构象的改变导致抗体的产生,进而影响PLT输注的疗效,出现输注耐受现象。PLT抗体包括特异性抗体和相关性抗体,分别由HPA、共同抗原(包括HLA和ABO、Lewis、P等红细胞血型抗原)免疫刺激而产生。本研究结果显示,98例患者长期输注PLT后,有52%的患者产生PLT抗体,有效输注率为77.8%。产生PLT抗体的患者并非每次输注随机的PLT都无效,本研究结果显示,HPA-3ab型患者输注有效率最高(78.9%),aa型居中(77.2%),bb型最低(76.3%)。这种情况可能与献血员的PLT血型有关。如aa型患者数量多于bb型,根据基因频率,此型献血员数量也应该多于bb型,而ab型患者可接受aa、bb和ab 3种基因型的PLT,这些因素可能是造成aa型和ab型患者PLT输注有效率略高的原因。此外,PLT相关抗体中的HLA抗体对PLT输注效果影响很大,故HPA-3ab型患者并非每次输注都有效,而且21例有抗体的患者输注65袋配合型的PLT后,疗效仅为83.1%。HPA抗体最易产生,但由于HLA更具多态性,因此HLA抗体更常见。机体产生的HLA抗体往往具有多特异性。当HLA抗体合并HPA抗体时,PLT输注无效更易发生。HLA抗体数量占主要地位,其次为HPA抗体[ 8, 9]。故PLT抗体是造成输注无效的免疫性原因,PLT GP多态性是产生PLT抗体的主要原因之一。

全世界每年用于治疗性输注的PLT有几百万单位,但随之而来的是由此而引发的同种免疫应答等造成的输注无效[ 10]。治疗PLT输注无效,应当从病因着手,采取不同的治疗方案。由非免疫因素引起的输注无效,应以治疗原发病为主,如抗感染、脾切除、增加PLT输注量来提高效果,而由免疫因素引起的,则应首先选择PLT相容性输注[ 11],即选择ABO同型、HLA和HPA交叉配型均相合的单采PLT输注[ 12],给患者输注“合适的PLT”,取代随机性PLT的输注[ 13]。但在实际工作中寻找三者完全相同的PLT非常困难,只有部分患者可在其亲属中找到,因此除依靠采血机构建立HLA和HPA供者分型库提供及时、有效的输注途径外,临床上使用去除白细胞的PLT、γ-辐照PLT、药物(丙种球蛋白)等也是必不可少的治疗方案。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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