H7N9禽流感患者外周血T淋巴细胞亚群的分析及意义

引用本文

毛会军, 陈戴红, 张敏, 王刚, 邱建萍. H7N9禽流感患者外周血T淋巴细胞亚群的分析及意义. 2013, 28(9): 758-761[MAO Huijun, CHEN Daihong, ZHANG Min, WANG Gang, QIU Jianping. Analysis and significance of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with avian influenza A (H7N9) virus infection. 上海检验医学, 2013, 28(9): 758-761] 复制到剪切板

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H7N9禽流感患者外周血T淋巴细胞亚群的分析及意义

毛会军, 陈戴红, 张敏, 王刚, 邱建萍

上海市公共卫生临床中心医学检验科,上海 201508

摘要

目的

探讨H7N9禽流感患者外周血T淋巴细胞亚群的变化情况。

方法

将18例H7N9禽流感患者(感染组)根据治疗预后分为治愈组13例和死亡组5例,以门诊健康献血者20名作为正常对照组。采用特异性引物聚合酶链反应(PCR)检测H7N9禽流感病毒,并用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群的变化。

结果

感染组CD3⁺、CD8⁺和CD4⁺T细胞绝对数及CD4⁺/CD8⁺比值均低于正常对照组(P<0.05)。治愈组CD3⁺、CD8⁺及CD4⁺T细胞绝对数均低于正常对照组(P<0.05)。与治疗前比较,治愈组治疗后CD3⁺、CD8⁺及CD4⁺T细胞绝对数明显升高(P<0.05);但CD3⁺、CD4⁺T细胞绝对数及CD4⁺/CD8⁺比值仍低于正常对照组(P<0.05)。死亡组治疗前、后CD3⁺、CD8⁺及CD4⁺T细胞绝对数均低于治愈组和正常对照组(P均<0.05);且治疗前、后各项指标之间差异均无统计学意义(P>0.05)。治愈组CD3⁺、CD8⁺及CD4⁺T细胞绝对数均高于死亡组(P<0.05)。

结论

H7N9禽流感患者存在比较严重的T淋巴细胞亚群失衡,死亡患者免疫失衡更为严重。T淋巴细胞亚群失衡可能与H7N9禽流感的发病有关。

关键词: H7N9禽流感病毒; T淋巴细胞亚群; 奥司他韦

中图分类号:R373.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)09-0758-04

Analysis and significance of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with avian influenza A (H7N9) virus infection

MAO Huijun, CHEN Daihong, ZHANG Min, WANG Gang, QIU Jianping

Department of Clinical Laboratory,Shanghai Public Health Clinical Center,Shanghai 201508,China

Abstract

Objective

To investigate the changes of peripheral blood T lymphocyte subsets in avian influenza A (H7N9) virus infection patients.

Methods

According to the prognosis,18 patients with avian influenza A (H7N9)virus infection (infection group) were classified into 13 cases of cure group and 5 cases of dead group. There were 20 healthy subjects as the control group. Specific primer polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the avian influenza A (H7N9)virus,and the T lymphocyte subsets in peripheral blood were detected by flow cytometry.

Results

Compared with the control group,the absolute numbers of CD3⁺T cell, CD8⁺T cell and CD4⁺T cell and CD4⁺/CD8⁺ ratio of the infection group decreased significantly (P<0.05). In the cure group,the absolute numbers of CD3⁺T cell, CD8⁺T cell and CD4⁺T cell were lower than those of the control group (P<0.05). In the cure group,the absolute numbers of CD3⁺T cell, CD8⁺T cell and CD4⁺T cell before the treatment were significantly lower than those after the treatment (P<0.05), and the absolute numbers of CD3⁺T cell and CD4⁺T cell and CD4⁺/CD8⁺ ratio were lower than those in the control group (P<0.05).In the dead group, the absolute numbers of CD3⁺T cell, CD8⁺T cell and CD4⁺T cell before and after the treatment were lower than those in the cure and control groups (P<0.05) , and there was no statistical significance for the all parameters before and after the treatment (P>0.05). Compared with the dead group,the absolute numbers of CD3⁺T cell, CD8⁺T cell and CD4⁺T cell in the cure group were higher (P<0.05).

Conclusions

There is the imbalance of T lymphocyte subsets in avian influenza A (H7N9)virus infection patients. In the dead group,the imbalance of T lymphocyte subsets is serious. The imbalance may be correlated with the pathogenesis of avian influenza A (H7N9)virus infection.

Keyword: Avian influenza A (H7N9)virus; T lymphocyte subset; Oseltamivir

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引言

2013年3月在上海及安徽3例已死亡的患者体内首次分离出一种新型的禽流感病毒H7N9,该新型病毒可导致严重的致死性呼吸系统疾病^{[ 1]}。疫情发生至今,H7N9禽流感已致上海、浙江、安徽、江苏、河南、北京等地130人感染,有37例患者死亡。为应对疫情,中国国家卫生和计划生委员会与世界卫生组织共同组织了“人感染H7N9禽流感防控联合考察组”,对我国的疫情开展为期1周的联合评估,分析、研判疫情和防控工作,为下一步防控措施提供建议。由此可见,积极预防和控制H7N9禽流感已成为我国极为迫切的公共卫生问题。对疾病致病机制的研究,有助于了解机体对该病毒的防御机制,从而为有效防治提供有效的理论支持。本次H7N9禽流感为突发疫情,上海市公共卫生临床中心作为上海市的定点医院收治了18例患者,其中5例死亡。由于病例数少,我们仅能初步探讨H7N9禽流感患者外周血T淋巴细胞亚群的变化,且结果有待今后更多临床病例及数据进行探讨。

材料和方法

一、对象

18例H7N9禽流感患者(感染组)均为上海市公共卫生临床中心2013年3月至2013年6月住院患者,男14例,女4例,年龄(73±15)岁。根据患者最终治疗结果,将感染组分为治愈组13例[男9例,女4例,年龄(69±10)]和死亡组5例[均为男性,年龄(77±14)岁]。临床诊断标准参照《人感染H7N9禽流感诊疗方案》(2013年第2版)^{[ 2]}。所有H7N9禽流感患者甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒(HEV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)相关检测均为阴性,排除酒精性及药物所致肝损伤及季节性流感;2例为慢性阻塞性肺病患者,其中1例死亡;1例同时患有风湿性关节炎,1例同时患前列腺增生,1例同时患胆囊炎,1例患者为乳腺癌术后。死亡组中2例入院后第2天死亡,未取得其治疗后T淋巴细胞亚群数据;1例入院治疗后1周后死亡;其余2例治疗40 d以上,入院后给予奥司他韦,75 mg/次,重症者加倍,一日2次,疗程为7 d,同时行支持治疗。正常对照组20名,男11名,女9名,年龄(34±7)岁,均为门诊健康献血者。

二、检测方法

1. T淋巴细胞亚群检测

所有患者均于住院第2天早晨空腹抽静脉血5 mL,其中2 mL采用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K₂)抗凝,3 mL不抗凝。治疗后T淋巴细胞亚群数据均为患者最后1次抽血检测。外周血T淋巴细胞亚群采用美国贝克曼-库尔特FC-500流式细胞仪及CD45-异硫氰酸荧光素(FITC)/CD4-藻红蛋白(RD1)/CD8-藻红蛋白德州红(ECD)/CD3藻红蛋白花青苷5(Pc5)四色荧光抗体检测。CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺T绝对细胞数及CD4⁺/ CD8⁺比值采用流式细胞仪和CXP软件进行荧光信号参数获取和分析。

2 H7N9禽流感病毒核酸检测

患者入院取呼吸道分泌物用于检测H7N9禽流感病毒核酸。

三、.统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计学处理。正态分布计量资料以 ±s表示,感染组与正常组比较用方差分析,各组治疗前、后比较采用配对 t检验。偏态分布数据以中位数(四分位数)表示,组间比较采用秩和检验。 P<0.05为差异有统计学意义。

结果

感染组CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺T细胞绝对数及CD4⁺/CD8⁺比值均低于正常对照组( P<0.05)。治愈组CD3⁺、CD8⁺及CD4⁺T细胞绝对数均低于正常对照组( P<0.05)。与治疗前比较,治愈组治疗后CD3⁺、CD8⁺及CD4⁺T细胞绝对数明显升高( P<0.05);但CD3⁺、CD4⁺T细胞绝对数及CD4⁺/CD8⁺比值仍低于正常对照组( P<0.05)。死亡组治疗前、后CD3⁺、CD8⁺及CD4⁺T细胞绝对数均低于治愈组和正常对照组( P均<0.05);且治疗前、后各项指标之间差异均无统计学意义( P>0.05)。治愈组CD3⁺、CD8⁺及CD4⁺T细胞绝对数均高于死亡组( P<0.05)。见表1:

表1 感染组T淋巴细胞亚群百分率和绝对数与正常对照组的比较

讨论

T淋巴细胞是主导机体免疫功能最主要的免疫细胞之一。CD4⁺T细胞在抗流感病毒中的首要提供辅助功能,以诱导B细胞的同型转换并调节免疫记忆的产生^{[ 3, 4]}。病毒特异性抗体使机体免受同型病毒的再次感染^{[ 5]}。然而,淋巴节中的病毒特异性CD8⁺T细胞转移至肺部并杀死感染细胞^{[ 3, 6]};在再次感染流感病毒时,病毒特异性CD8⁺T细胞是保护性免疫记忆的重要组成部分。同时,病毒特异性T淋巴细胞相关的细胞免疫在缓解流感症状和病毒清除中起重要作用^{[ 7, 8]}。

动物模型和人体研究均验证CD4⁺T细胞和细胞毒性T细胞(活化的CD8⁺T细胞)是宿主抵抗肺部感染的主要细胞^{[ 9]}。研究表明。季节性流感病毒诱导产生的CD8⁺T细胞在体外经A(H1N1)pdm09 and A(H3N2)流感病毒再刺激后可产生γ-干扰素。同时,A(H1N1)pdm09流感病毒诱导产生的CD8⁺T细胞与A(H3N2)流感病毒显示出高水平的交叉反应^{[ 10]}。以往研究发现,2009甲型H1N1流感患者外周血T细胞亚群( CD3⁺ ) 、T辅助细胞( CD3⁺CD4⁺ ) 和T 抑制/诱导细胞( CD3⁺ CD8⁺ ) 与健康者相比,绝对计数均下降,而百分率无明显变化^{[ 11]}。这与Perez-Padilla等^{[ 12]}报道61%H1N1感染者淋巴细胞数量低下的结果一致。本研究中18例H7N9禽流感患者CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺T细胞绝对数及CD4⁺/CD8⁺比值均低于正常对照组,同时CD3⁺T细胞百分率和CD8⁺T细胞百分率也低于正常对照组。表明H7N9禽流感患者体内可能存在一定的免疫紊乱或免疫失衡,这可能是因为病毒的募集作用使病毒性肺炎患者肺部积聚大量淋巴细胞与活化的巨噬细胞^{[ 13]} ,导致外周血淋巴细胞数降低。

本研究还发现,治愈组治疗后H7N9禽流感患者外周血CD3⁺、CD8⁺及CD4⁺T细胞绝对数高于治疗前( P<0.05)。提示经过治疗,患者体内免疫失衡得到一定程度的缓解或纠正。治愈组外周血CD3⁺、CD8⁺及CD4⁺T细胞绝对数高于死亡组( P<0.05),提示患者体内免疫失衡的严重性可能与其疾病预后有一定相关性。同时,无论患者最终治愈或者死亡,经治疗后,患者外周血CD3⁺、CD8⁺及CD4⁺T细胞绝对数均有一定程度上升,治愈患者较治疗前升高明显,而死亡患者升高不明显。本次H7N9禽流感为突发疫情,本院仅收治了18例H7N9禽流感患者,其中5例死亡。由于病例数少,该结果还有待今后更多临床病例及数据进行确认。

由于是突发疫情,本研究中H7N9禽流感患者例数较少,且患者年龄偏高,部分患者还同时存在一定的基础疾病。因此,患者病程长短差异较大,从3 d到40 d不等,无法动态监测其T淋巴细胞亚群的变化。同时,5例死亡患者中有2例入院后第2天即死亡,导致死亡组治疗后有效病例数仅为3例。故本研究只能对H7N9禽流感患者外周血T淋巴细胞亚群变化做基础性分析,并为之后特异性T淋巴细胞与H7N9禽流感发病机制相关性研究及其与其他流感病毒是否存在交叉反应提供一定的基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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... 引言2013年3月在上海及安徽3例已死亡的患者体内首次分离出一种新型的禽流感病毒H7N9,该新型病毒可导致严重的致死性呼吸系统疾病^[1] ...

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... 临床诊断标准参照《人感染H7N9禽流感诊疗方案》(2013年第2版)^[2] ...

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... CD4⁺T细胞在抗流感病毒中的首要提供辅助功能,以诱导B细胞的同型转换并调节免疫记忆的产生^[3,4] ...

... 然而,淋巴节中的病毒特异性CD8⁺T细胞转移至肺部并杀死感染细胞^[3,6] ...

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... CD4⁺T细胞在抗流感病毒中的首要提供辅助功能,以诱导B细胞的同型转换并调节免疫记忆的产生^[3,4] ...

2007

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. 2007, 25(4):612-620 DOI:10.1016/j.vaccine.2006.08.036

Primary influenza A virus infection induces cross-protective immunity against a lethal infection with a heterosubtypic virus strain in mice

Abstract

In order to assess the level of protection against a lethal influenza virus infection provided by a primary infection with a virus strain of another subtype, C57BL/6 mice were infected with the sublethal influenza virus X-31 (H3N2) and subsequently challenged with the lethal strain A/PR/8/34 (H1N1). The outcome of the challenge infection was compared with that in mice that did not experience an infection with influenza virus X-31 prior to the challenge infection. The X-31 experienced mice cleared the infection with influenza virus A/PR/8/34 in an accelerated fashion, displayed less clinical signs and a reduction of lesions in the lungs resulting in improved survival rates of these mice compared to the naive mice. The improved outcome of the challenge infection with influenza virus A/PR/8/34 in the X-31 experienced mice correlated with priming for anamnestic virus-specific CD8⁺ cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses as was demonstrated by the detection of CTL specific for the H-2D^b restricted NP_366–374 epitope that was shared by the influenza viruses X-31 and A/PR/8/34. Thus previous exposure to influenza A viruses affords partial protection against infection in the absence of virus-neutralizing antibodies specific for the hemagglutinin and the neuraminidase. The implications of these observations are discussed in the light of the current pandemic threat and development of vaccines that aim at the induction of virus-specific CTL.

... 病毒特异性抗体使机体免受同型病毒的再次感染^[5] ...

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... 然而,淋巴节中的病毒特异性CD8⁺T细胞转移至肺部并杀死感染细胞^[3,6] ...

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... 同时,病毒特异性T淋巴细胞相关的细胞免疫在缓解流感症状和病毒清除中起重要作用^[7,8] ...

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... 同时,病毒特异性T淋巴细胞相关的细胞免疫在缓解流感症状和病毒清除中起重要作用^[7,8] ...

2005

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... 动物模型和人体研究均验证CD4⁺T细胞和细胞毒性T细胞(活化的CD8⁺T细胞)是宿主抵抗肺部感染的主要细胞^[9] ...

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... 同时,A(H1N1)pdm09流感病毒诱导产生的CD8⁺T细胞与A(H3N2)流感病毒显示出高水平的交叉反应^[10] ...

2009

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... 以往研究发现,2009甲型H1N1流感患者外周血T细胞亚群( CD3⁺ ) 、T辅助细胞( CD3⁺CD4⁺ ) 和T 抑制/诱导细胞( CD3⁺ CD8⁺ ) 与健康者相比,绝对计数均下降,而百分率无明显变化^[11] ...

2009

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... 这与Perez-Padilla等^[12]报道61%H1N1感染者淋巴细胞数量低下的结果一致 ...

2005

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... 表明H7N9禽流感患者体内可能存在一定的免疫紊乱或免疫失衡,这可能是因为病毒的募集作用使病毒性肺炎患者肺部积聚大量淋巴细胞与活化的巨噬细胞^[13] ,导致外周血淋巴细胞数降低 ...