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刘国政, 刘方方, 晏文强, 刘双, 谢明水, 许诚楷, 蒋从清. 乙醛脱氢酶ALDH7A1基因多态性与2型糖尿病的相关性研究 . 2013, 28(10): 897-901[LIU Guozheng, LIU Fangfang, YAN Wenqiang, LIU Shuang, XIE Mingshui, XU Chengkai, JIANG Congqing. Research on the correlation of the acetaldehyde dehydrogenaseALDH7A1 gene poly morphism and type 2 diabetes mellitus . 上海检验医学, 2013, 28(10): 897-901]  
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乙醛脱氢酶ALDH7A1基因多态性与2型糖尿病的相关性研究
刘国政, 刘方方, 晏文强, 刘双, 谢明水, 许诚楷, 蒋从清
随州市中山医院,湖北 随州 441300

刘国政,男,1967年生,博士,主任技师,主要从事分子生物学研究。

摘要
目的

探讨ALDH7A1基因多态性位点rs2306619、rs2306618、rs12514417、rs2306617、rs4379190与中国湖北随州汉族居民2型糖尿病(T2DM)的相关性。

方法

收集220名健康对照者和240例T2DM患者,所有研究对象均来自湖北随州汉族城镇居民。从外周血的白细胞中应用标准法提取DNA。通过设计测序引物对相邻的5个所选位点(rs2306619、rs2306618、rs12514417、rs2306617、rs4379190)进行基因扩增,然后直接送样测序,采用SHEsis软件进行统计分析ALDH7A1基因5个位点的单核甘酸多态性及连锁不平衡,分析糖尿病组与对照组5个位点等位基因频率和基因型频率的差异及构建单体型。

结果

5个位点的最低等位基因频率分别是0.492、0.084、0.124、0.277、0.259,连锁不平衡检验发现5个位点呈现强的连锁不平衡,ALDH7A1基因的5个位点基因的等位基因频率和基因型频率在2组中差异均无统计学意义,单体型分析发现C-A-A-A-T、T- A- A- A-T、T-A-A-G-C、T-A-C-A-T、T-G-A-G-C 5种单体型,并且这5种单体型在糖尿病组和对照组差异无统计学意义。

结论

ALDH7A1基因的5个多态性位点可能不是湖北随州汉族2型糖尿病患者的易感基因;本研究结果尚需在更大规模人群中进一步验证。

关键词: 2型糖尿病; ALDH7A1基因; 单核苷酸多态性; 单倍体
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)10-897-05
Research on the correlation of the acetaldehyde dehydrogenaseALDH7A1 gene poly morphism and type 2 diabetes mellitus
LIU Guozheng, LIU Fangfang, YAN Wenqiang, LIU Shuang, XIE Mingshui, XU Chengkai, JIANG Congqing
Suizhou Central Hospital, Hubei Suizhou 441300, China
Abstract
Objective

To study the correlation ofALDH7A1 gene polymorphism locus rs2306619, rs2306618, rs12514417, rs2306617 and rs4379190 with type 2 diabetes mellitus among Chinese Hubei Suizhou Han population.

Methods

A total of 220 healthy controls and 240 unrelated patients with type 2 diabetes mellitus were enrolled, and all of them were from Han urban residents in Hubei Suizhou. The DNA was extracted from white blood cell of peripheral blood by standard method. The 5 polymorphism loci (rs2306619, rs2306618, rs12514417, rs2306617 and rs4379190) were amplified through designed sequence primer, and the sequence analysis was performed. The single nucleotide polymorphism and linkage disequilibrium ofALDH7A1 gene 5 polymorphism loci were analyzed statistically by SHEsis software. The differences and haplotypes of 5 locus allele frequencies and genotype frequencies were compared between type 2 diabetes mellitus group and control group.

Results

Five locus minimum allele frequencies were 0.492, 0.084, 0.124, 0.277 and 0.259. Linkage disequilibrium test showed 5 loci with strong linkage disequilibrium. TheALDH7A1 gene 5 locus allele frequencies and genotype frequencies in the 2 groups had no statistical significance. Haplotype analysis showed C-A-A-A-T, T- A- A- A-T, T-A-A-G-C, T-A-C-A-T and T-G-A-G-C haplotypes, and the 5 haplotypes in type 2 diabetes mellitus group and control group had no statistical significance.

Conclusions

The 5 polymorphism loci ofALDH7A1 gene may be the susceptibility genes for the patients with type 2 diabetes mellitus in Chinese Hubei Suizhou Han population. The results of the present study are needed to validate in larger populations.

Keyword: Type 2 diabetes mellitus; ALDH7A1 gene; Single nucleotide polymorphism; Haploty
引言

醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)广泛存在于细菌、植物、动物和昆虫,形成了一个酶蛋白超家族,该超家族成员在NAD(P)+存在条件下可催化多种内源和外源醛生成对应的酸。ALDH7A1醛脱氢酶7家族成员A1(aldehyde dehydrogenase 7 family, member A1 )是醛脱氢酶超家族中的一个亚家族,位于人类染色体5q31,具有18个外显子,共编码510个氨基酸,存在于肾脏、卵巢及心脏的胞质液、线粒体基质和细胞核内,因其氨基酸序列在不同的物种间有高度的相似性,因而也命名为“Antiquitin”[1]。其功能尚未明确,但参与体内氧化应激[2]、醛代谢,与肥胖[3]、骨质疏松[4]等疾病相关。基于以上研究,我们推测 ALDH7 A1的基因变异可能与糖尿病存在关联。我们利用hapview软件对该基因分析,发现共存在4个BLOCK,31个SNP位点,我们标记了19个,即19个tag SNP,其中rs2306619、rs2306618、rs12514417、rs2306617、rs4379190这5个位点集中在BLOCK2区域,大概在550个碱基左右,因此,我们先尝试采用普通测序的方法来比较这几个位点在湖北随州汉族居民糖尿病组和正常对照组中有没有差异。为中国汉族人群2型糖尿病(T2DM)的基因学分析提供数据。

材料和方法
一、研究对象

收集2009年12月至2010年6月前来随州市中心医院就诊或住院治疗的240例T2DM患者和220名健康对照者。T2DM患者的入选标准如下:(1)确诊T2DM 时年龄>30 岁;(2)初次确诊T2DM的患者;(3)通过个人史和家族史将青少年成人发病型糖尿病(MODY)、1型糖尿病和母系遗传糖尿病排除;排除继发型糖尿病,患者之间无血缘关系。前来本院体检的健康人群240名。健康对照组:空腹血糖<5.60 mmol/L,没有服用影响糖脂代谢的药物,无其他系统性疾病,且一级亲属无糖尿病病史,年龄、文化程度、工作性质尽量与糖尿病组相匹配,年龄越大文化程度越高无糖尿病史的老年人为最佳人选。所有研究对象均为湖北随州地区汉族居民,在调查和采集标本前均签订由随州市伦理学会审核的同意书。

二、问卷调查及体格检查

问卷调查包括询问调查者一般情况,糖尿病及其他病史,临床表现、饮食调查、宗教信仰、吸烟饮酒情况及体力活动等;体格检查包括身高、体重、腰围、臀围、身体阻抗读数及血压等。

三、实验室一般检查

实验室一般检查包括血浆葡萄糖、血清尿素、肌酐、尿酸、钙、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、胰岛素、C肽。

四、外周血白细胞 DNA 提取

抽取外周血10 mL,2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,630× g离心15 min,取白细胞层备用,用北京天根公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒(非离心柱型)提取白细胞DNA,置-80 ℃保存。

五、基因扩增及测序

引物由上海英骏生物技术有限公司合成。测序引物上游序列:CCTACACAGCCCAGGATTAAG;下游序列:CTATCCCTGCCTGACTCCTT。运用ABI7500实时荧光聚合酶链反应(PCR)仪进行扩增,反应条件为: 95℃变性5 min,每个循环95℃变性15 s、 60℃退火20 s、延伸30 s,共30个循环,然后72℃延伸5 min。PCR产物送上海英骏生物技术有限公司进行DNA序列分析。

六、基因分型

根据样本测序图谱,经人工比对对各位点进行基因分型。

七、统计学方法及分析

所有数据应用统计分析软件包SHEsis检验基因型频率是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,检测糖尿病组和健康对照组之间的基因型频率以及等位基因频率的差异, 分析 ALDH7 A1基因的5个SNP位点间连锁不平衡并进行单倍体分析,以 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、PCR产物测序图谱

基因组DNA经过特异性片段扩增后,送上海英骏生物技术有限公司进行纯化和测序,经比对分析,得到各样本的等位基因和基因型。

二、5个位点等位基因频率和基因型频率及Hardy-Weinberg遗传平衡检验

分析样本中,位点rs2306619以杂合子CT多见,纯合子TT次之,CC型最少;rs2306618以纯合子AA多见,杂合子AG次之,GG型最少; 位点rs12514417以纯合子AA多见,杂合子AC次之,CC型最少; 位点rs2306617以纯合子AA多见,杂合子AC次之,CC型最少; 位点rs4379190以纯合子TT多见,杂合子CT次之,CC型最少。Hardy-Weinberg遗传平衡检验显示位点rs2306618不符合Hardy-Weinberg遗传平衡,其余位点 P值均>0.05,具有群体代表性。结果见表1:

表1 SNP位点等位基因频率和基因型频率及Hardy-Weinberg遗传平衡检验
三、糖尿病组和对照组等位基因频率和基因型频率比较

利用SHEsis软件进行卡方检验显示在糖尿病组和对照组中,5个位点的等位基因频率和基因型频率差异均无统计学意义。结果见表2:

表2 糖尿病组和对照组等位基因频率和基因型频率比较
四、5位点遗传不平衡分析

应用软件对5个位点进行两两LD分析,显示位点rs2306618与rs12514417之间D`=0.048,约为0.5,<0.7,无连锁不平衡现象,图中以白色显示(图1);其他位点间均表现出较强的连锁不平衡,以不同程度的深浅表示。

图1 ALDH7 A1基因LD连锁分析及频率
五、糖尿病组和对照组单体型比较

利用软件分别构建糖尿病组和对照组的单体型,以频率>0.03为准,主要有5种单体型,以 CAAAT为主,TAAAT次之,其他单体型为TAAGC,TACAT和TGAGC,结果见表3:

表3 ALDH7 A1基因SNP位点构建单体型及比较
讨论

ALDH7 A1基因在植物界的功能研究比较透彻,比如参与物质代谢[2],渗透压调节和细胞解毒等,而对人体 ALDH7 A1功能的研究尚处于起步阶段。Brocker等[3]研究发现,在中国仓鼠卵巢细胞内, ALDH7 A1可以通过催生甜菜碱,清除有毒物质和减少高渗诱导的细胞凋亡来对抗高渗刺激,该研究组同时发现, ALDH7 A1在氧化应激和脂质过氧化中对细胞也起到了绝对性的保护作用[5]。2008年在东亚和西非人群分别进行的全基因组关联研究筛查出 ALDH7 A1(rs2306617)基因变异可能与T2DM或肥胖存在关联,Guo 等[6]在采用全基因组关联研究(GWAS)方法筛选骨质疏松症的侯选基因时发现,无论在中国人群中还是高加索人群中, ALDH7 A1(rs13182402)都可以作为骨质疏松症的易感基因位点。最新研究显示脂代谢异常与氧化应激异常是T2DM发生的重要机制[7,8,9],而糖尿病患者易发生骨质疏松并发症,从这个角度讲 ALDH7 A1基因多态性与T2DM可能存在联系。我们先尝试采用普通测序的方法来比较这几个位点在糖尿病组和对照组中有没有差异。

本研究首先对所分析样本各位点进行Hardy-Weinberg平衡分析发现,位点rs2306618和rs4379190不符合Hardy-Weinberg平衡要求,但进行分组后,再分别进行Hardy-Weinberg平衡分析,发现对照组各位点都符合Hardy-Weinberg平衡,具有群体代表性。经分析认为实验组位点rs2306618和rs4379190不符合Hardy-Weinberg平衡,可能是糖尿病造成Hardy-Weinberg检验部平衡的外在选择压力,不能否认此次样本的群体代表性。 我们对测序图谱分析发现,rs2306619、rs2306618、rs12514417、rs2306617、rs4379190这5个位点的最小等位基因频率(MAF)分别为0.492、0.084、0.124、0.277、0.259,这与北京汉族居民基本相同。

对实验组和对照组中各位点进行基因频率和基因型频率分析发现,5个位点的等位基因频率在实验组和对照组均无显著性差异, P值分别为0.928 2、0.974 9、0.397 6、0.751 1、0.589 9;其基因型频率在实验组和对照组差异亦无统计学意义, P值分别为0.791 7、0.867 2、0.483 4、0.677 5、0.668 7,位点rs2306617的等位基因频率和基因型频率在实验组和对照组差异均无统计学意义,这与Zhou等报道的结果一致。

为分析 ALDH7 A1基因这5个位点之间的关系,我们对他们进行两两LD分析,发现除rs2306618与rs12514417之间,并不显示出连锁不平衡,分析其原因是rs2306618位点的MAF值仅为0.084,可能此次样本量相对于该位点不够充分,导致LD分析数值D仅为0.048。另外,其他位点两两之间均表现明显的连锁不平衡,如图1所示.这表明5位点共同位于同一单体域内,与我们预期结果一致。

应用软件我们对这5个位点构建单体型,并计算各型频率,以频率>0.03为准,共获得5种单体型,无论在实验组和对照组,均以CAAAT为主,TAAAT次之,其他单体型为TAAGC、TACAT和TGAGC,这也表明这5个位点存在强的连锁不平衡。另外,这5种单体型在糖尿病组和对照组并不存在显著性差异,这表明5个位点所在区域可能与湖北随州汉族T2DM并无关联,但还需扩大样本量进一步验证。

总之,本次试验提供了湖北随州汉族居民 ALDH7 A1基因部分位点的群体学遗传资料,并初步分析了该基因5个SNP位点与T2DM的关系,虽然数据显示该基因5个位点多态性与T2DM并无关联,但还需扩大样本量来进一步证实。

The authors have declared that no competing interests exist.

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