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孙杰, 徐炜新, 时建英, 吉建, 刘春红, 曹文俊. 肺炎克雷伯菌的耐药性和防耐药突变浓度的初步研究. 2013, 28(10): 878-881[SUN Jie, XU Weixin, SHI Jianying, JI Jian, LIU Chunhong, CAO Wenjun. Preliminary study on drug resistance and mutant prevention concentration ofKlebsiellapneumonia . 上海检验医学, 2013, 28(10): 878-881]  
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肺炎克雷伯菌的耐药性和防耐药突变浓度的初步研究
孙杰1, 徐炜新1, 时建英1, 吉建2, 刘春红2, 曹文俊2
1. 上海市嘉定区中心医院检验科, 上海 201800
2. 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院检验科, 上海 200031

孙杰,男,1969年生,学士,副主任技师,主要从事临床微生物检验工作。

基金:嘉定区科委科学发展基金(2010021);
摘要
目的

了解临床分离的肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药性,并测定氟喹诺酮类药物( FQNs) 对肺炎克雷伯菌的防耐药突变浓度( MPC)能力进行分析。

方法

采用微量稀释法测定肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度( MIC) 、琼脂稀释法测定MPC, K-B法测定常用抗菌药物的耐药性。

结果

30株临床分离的肺炎克雷伯菌中超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性15株,为阳性组;阴性15株,为阴性组。2组对临床常用抗菌药物的耐药性存在较大差异,ESBLs阳性组的耐药率明显高于ESBLs阴性组。左氧氟沙星和莫西沙星对ESBLs阳性和ESBLs阴性的肺炎克雷伯菌的MPC、MIC和耐药选择指数(SI)具有不同的分布特征。

结论

30株临床分离的肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药性以ESBLs阳性株较为严重,且MPC明显高于ESBLs阴性株,ESBLs阴性株的细菌SI较高,临床应给予高度关注。

关键词: 肺炎克雷伯菌; 耐药性; 防耐药突变浓度; 超广谱β; -内酰胺酶
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)10-878-04
Preliminary study on drug resistance and mutant prevention concentration ofKlebsiellapneumonia
SUN Jie1, XU Weixin1, SHI Jianying1, JI Jian2, LIU Chunhong2, CAO Wenjun2
1.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiJiadingCentralHospital,Shanghai 201800,China
2.DepartmentofClinicalLaboratory,EyeandENTHospitalofFudanUniversity,Shanghai 200031,China
Abstract
Objective

To study the drug resistance ofKlebsiellapneumoniae to common antibiotics, and to measure the mutant prevention concentration (MPC) of fluoroquinolone (FQNs) and analyze the anti-drug resistance mutation ability.

Methods

The minimum inhibition concentration (MIC) was determined by micro-dilution method, and MPC was determined by agar dilution method. The drug resistance to common antibiotics was measured by K-B method.

Results

A total of 30 clinical isolates ofKlebsiellapneumoniae had extended-spectrum beta lactamases (ESBLs) positive (15 isolates, positive group) and negative (15 isolates, negative group). The results showed that the drug resistance to common antibiotics had significant difference. The drug resistance rate of ESBLs positive group was higher than that of ESBLs negative group.The MPC, MIC and drug resistance selection index (SI) of levofloxacin and moxifloxacin for ESBLs positive and ESBLs negativeKlebsiellapneumoniae showed different distribution characteristics.

Conclusions

For the 30 isolates ofKlebsiellapneumoniae, the drug resistance to common antibiotics of ESBLs positive isolates is serious, and MPC and SI are significantly higher than those of ESBLs negative isolates.

Keyword: Klebsiella pneumoniae; Drug resistance; Mutant prevention concentration; Extended-spectrum beta lactamase
引言

肺炎克雷伯菌( klebsiella pneunonia, KP)通常存在于人类呼吸道,是临床常见的条件致病菌。氟喹诺酮类药物(FQNs)是治疗肺炎克雷伯菌感染的常用药, 但由于其广泛应用,甚至滥用,导致肺炎克雷伯菌对其耐药性逐年递增[ 1]。防耐药突变浓度( mutant prevention concentration, MPC)在关注抗菌药物预防细菌耐药变异的同时, 对临床医师的用药也起到了重要的作用。关于MPC 的研究国内、外已有报道[ 2, 3],但对肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)与MPC相关的研究报道较少。本研究分析上海市嘉定区中心医院临床分离的肺炎克雷伯菌的ESBLs情况和对15种常用抗菌药物的耐药性,测定FQNs对肺炎克雷伯菌的MPC,为临床合理应用FQNs 药物提供参考。

材料和方法
一、菌株来源

临床分离的30株肺炎克雷伯菌来自上海市嘉定区中心医院2011年1月至10月患者。

二、试剂

MH肉汤 、MH琼脂、LB肉汤培养基均购自上海伊华生物科技有限公司(批号:20110506) 。

三、抗菌药物

常用的15种抗菌药物均由上海钰森公司提供的英国OXOID生产分别为:阿米卡星、氨苄西林、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢他啶、头孢呋辛酯、头孢呋辛钠、庆大霉素、亚胺培南、美洛培南、哌拉西林-他唑巴坦、左旋氧氟沙星、头孢哌酮-舒巴坦。 左氧氟沙星由扬子江药业集团有限公司生产(批号:1103032336;效价:0.2 g/2 mL;有效期:18个月)。莫西沙星由拜耳制药有限公司生产(批号:1103113254;效价:0.4 g/250 mL;有效期:36个月)。

四、方法

1.体外药敏试验(K-B) 按照《全国临床检验操作规程》(第3版)及2010版美国临床实验室标准化协会(CLSI)进行。质控菌株为:大肠埃希菌(ATCC 25922)。

2.ESBLs检测

双纸片协同法[ 4],质控菌株为:(ATCC 35218),结果判断依据CLSI 2010版相关规定。

3.左氧氟沙星和莫西沙星最低抑菌浓度(MIC)测定

琼脂对倍稀释法测定左氧氟沙星和莫西沙星肺炎克雷伯菌的MIC,判断按照CLSI 2010 版标准。

4.MPC的测定

将抗菌药物按对倍法稀释成不同的浓度, 药液和MH 琼脂培养基按1∶9 的比例在直径90 mm 的平板中混匀, 配制成系列浓度的含药平板, 置37 ℃孵箱中培养过夜。在新鲜过夜培养的细菌平板上挑取单个菌落接种于MH 肉汤中37 ℃ 震荡过夜培养, 离心后将细菌重悬于10倍的MH 肉汤中, 37 ℃震荡培养6 h 离心集菌后, 把菌液调至1010 CFU /mL, 取100 μL 均匀地涂在制备好的含药平板上, 于37 ℃孵育24、48、72 h 后观察结果, 以不出现细菌生长的最低药物浓度为该药对这种细菌的MPC 值。

结果
一、30株ESBLs肺炎克雷伯菌对15种抗菌药物的耐药性结果

ESBLs阳性组的耐药率明显高于ESBLs阴性组,与国内文献报道相符合[ 5],结果见表1:

表1 30株ESBLs肺炎克雷伯菌对15种抗菌药物的耐药率(%)
二、MPC、MIC和耐药选择指数(SI)的测定结果

30株肺炎克雷伯菌的MIC和MPC测定,结果见表2:

表2 肺炎克雷伯菌的MIC、MPC和SI测定结果

ESBLs阳性的MIC、MPC和SI与ESBLs阴性具有不同的特点。

讨论

肺炎克雷伯菌是临床常见的条件致病菌,在正常人群中的带菌率约5%,但在住院患者中带菌率可高达20%,是酒精中毒、糖尿病和慢性阻塞性肺病患者并发肺部感染的潜在的危险因素。可引起典型的原发性肺炎,还可引起肠道感染、泌尿系统感染、伤口感染及新生儿脑膜炎等,耐药性也较高。因此,对病原菌谱及其耐药性作动态监测、并适时向临床作反馈和开展定期的医/技之间的细菌耐药性监测阶段回顾就变得十分必要[ 5]。

体外药敏试验虽然可以获得细菌针对不同药物的敏感性和耐药性的定性和定量结果,然而体外试验结果呈敏感的抗菌药物在实际临床应用中常出现与实验室不相吻合的耐药性现象,可能有多种原因造成这一现象,我们认为主要是因为患者个体差异以及细菌耐药性发生较为快速的变化所导致。导致细菌耐药性快速地出现日益严重的现状,究其原因是临床滥用抗菌药物造成的,而日常生活中,社会人群经常接触各种不同种类和剂量的非医源性抗菌药物,也是导致耐药菌得到筛选、耐药性不断增强的重要原因。

革兰阴性菌产生耐药性的一个重要原因是其产生ESBLs,影响了抗菌药物有效发挥作用。临床分离的革兰阴性菌中ESBLs的流行率情况、其MIC和MPC等重要参数之间的相互关系对临床流行病学资料的统计分析、选择正确抗菌药物并确定适当的使用浓度和使用期限具有重要的参考价值。本研究结果显示,ESBLs阳性的菌株除了对临床常用的抗菌药物具有较普遍的耐药性之外,其对左氧氟沙星和莫西沙星的MIC也呈现出明显升高的趋势,提示其临床使用中对其耐药性变化趋势应给予高度重视;值得引起关注的是,ESBLs导致MIC升高的同时,MPC的升高也较明显,而SI也变得较小。这些结果表明,今后临床通过增加用药量和延长用药时间的手段达到预防耐药突变的措施的难度更大而可操作性变得较为困难。

由于临床分离的菌株的变异性日益增大、而耐药性逐步增强且变化快和差异大,导致这些变化的分子机制复杂[ 6, 7]。因此,本研究主要通过检测ESBLs表达对MPC、MIC和SI的影响,初步探讨如何根据临床合理使用抗菌药物的需求。针对本区域内临床分离肺炎克雷伯菌的耐药特点,配合临床开展耐药性预防的实验诊断工作,并初步探索ESBLs表达与细菌耐药性监测和预防耐药发生的相互关系。基于以上考虑,虽然本研究所采用的菌株数量较少,但结果提示后续值得深入研究,除了加大样本量并及时取得临床的反馈与合作,还应在此基础上从分子机制角度做进一步的深入研究,对其他革兰阴性菌的相关研究也应给予高度关注[ 5, 6, 7]。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[2] 宋秀杰, 王睿, 于旭红, 等. 防细菌耐药突变浓度理论文献计量分析[J]. 中国药物应用与监测, 2010, 7(4): 247-251. [本文引用:1]
[3] Credito K, Kosowska-Shick K, McGhee P, et al. Comparative study of the mutant prevention concentrations of moxifloxacin, levofloxacin, and gemifloxacin against pneumococci[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(2): 673-677. [本文引用:1] [JCR: 4.565]
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