我们既往的研究发现原发性肝癌组织中 p16基因发生甲基化的频率非常高,并且通过分组发现乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染相关肝癌的 p16基因甲基化的频率要高于非HBV相关肝癌,提示HBV的持续感染对 p16基因的异常甲基化有一定作用,但其作用机制尚不明确^{[ 1, 2, 3]}。基因的异常甲基化可能与多种因素有关,包括甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT) 水平、致癌物接触、基因修复缺陷等,其中DNMT是调节甲基化的主要因素。为了解HBV感染与DNMT表达之间的关系,本研究采用荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测44例原发性肝癌组织和HBV相关肝癌细胞系Hep3B、非HBV相关肝癌细胞系HepG2中4种DNMT mRNA(DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B)的表达情况,初步探讨DNMT mRNA表达改变与HBV感染及肝癌等的关系。

至今发现的DNMT至少有4种亚型,分别为:DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B,主要功能是维持甲基化和全程甲基化。甲基化是在DNMT的催化作用下加到C上形成^mC^{[ 4]},从理论上讲应与DNMT的结构和/或活性异常有关。DNMT1的主要功能是保证新合成的DNA具有高度的保真性,并且维持甲基化转移酶的功能^{[ 5]}。DNMT2的作用目前尚不明确,可能与着丝粒区域的甲基化控制有关。DNMT3A和DNMT3B在原始胚胎形成中起重要的作用,主要功能是催化DNA甲基化的新生位点。正常细胞DNMT1的过度表达可导致CpG岛超甲基化,促进细胞转化。有研究表明,部分肿瘤细胞的DNMT水平表达明显高于正常细胞,并且与某些抑癌基因的超甲基化状态相关^{[ 6]}。在细胞周期中不同的DNMT mRNA可能受不同的调节机制调控,异常的DNMT表达可引起甲基化改变,且DNMT功能改变可引起异常甲基化或正常甲基化模式的丢失,导致DNA甲基化模式的转换。与DNMT相关的因素可能有:(1)与DNMT1忠诚性有关;(2)与DNMT3A和DNMT3B的错误靶向有关;(3)与错误的甲基化修复机制有关;(4)与DNMT的活性异常有关;(5)与染色质构型重塑(chromatin remodeling)有关。

HBV感染与肝癌之间的关系十分密切,流行病学调查发现肝癌患者HBsAg阳性率可达90%^{[ 7]}。国内外的研究也表明持续的HBV感染所导致的部分抑癌基因甲基化是肝癌发生、发展过程中的早期事件^{[ 3, 8, 9]}。虽然持续的HBV感染可以导致部分抑癌基因的甲基化发生,但是这其中的机制尚不明确。本研究采用定量PCR检测HBV相关性与非HBV相关性肝癌细胞系中4种DNMT mRNA表达水平的变化,探讨HBV感染是否对一种或多种DNMT mRNA的表达水平产生影响。

在本结果中发现HBV感染肝癌组织和非HBV感染肝癌组织间DNMT mRNA表达水平不同。HBV感染相关肝癌组织中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA水平明显高于非HBV感染相关癌组织,还发现可分泌HBsAg的Hep3B细胞这3种DNMT mRNA表达也高于HBsAg阴性的HepG2细胞。上述试验结果表明HBV的病毒组分可以剌激受染细胞DNMT mRNA的表达,进而促进抑癌基因的甲基化。甲基化酶的表达异常改变可能与基因异常甲基化和肿瘤形成有关,在多种肿瘤中均可见DNMT mRNA的过度表达。国内许军等^{[ 10]}在研究人肝癌细胞株、人正常肝细胞株及癌旁细胞株中DNMT3B的表达发现,肝癌细胞株中DNMT3B mRNA的表达要明显高于正常和癌旁细胞株,提示DNMT3B的高表达可能与肝癌的发生相关。

病毒感染与DNMT之间的这种关系并不只存在于肝癌细胞中。有研究表明除HBV外的其他病毒及其组分也可通过激活DNMT的活性从而进一步使抑癌基因的表达下降。Tsai等^{[ 11]}在培养的鼻咽癌细胞系中发现,经过EB病毒感染的癌基因产物(LMP-1)能够诱导DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达,进而使 E-cadherin基因发生甲基化。EB病毒是胃癌发生的一个潜在危险因子,研究发现,在胃癌发生过程中,DNMT1的高表达与h-MLH、thrombospondin-1、E-cadherin等基因启动子甲基化和CpG岛甲基化表型相关,并且这些基因的甲基化均与EB病毒感染有关^{[ 12]}。HB病毒感染、DNMT活性改变、基因甲基化都是肝癌形成的早期事件,那么从某种程度上讲,三者具有潜在的关联,HBV感染作为肝癌形成的一个外部生物因子,可能通过刺激 DNMT基因的表达,进而促进抑癌基因甲基化而参与肝癌形成,这也为了解肝癌的发生机制提供了一个新的思路。