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宋云霄, 欧美贤, 李水军, 张海晨, 余琛. 同位素稀释质谱法、酶法和碱性苦味酸法测定血清肌酐方法比较. 2013, 28(8): 698-703[SONG Yunxiao, OU Meixian, LI Shuijun, ZHANG Haichen, YU Chen. Methodology comparison of serum creatinine determined by isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry,enzymatic method and Jaffe method. 上海检验医学, 2013, 28(8): 698-703]  
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同位素稀释质谱法、酶法和碱性苦味酸法测定血清肌酐方法比较
宋云霄1, 欧美贤2, 李水军2, 张海晨1, 余琛2
1.上海市徐汇区中心医院检验科,上海 200031
2. 上海市徐汇区中心医院中心实验室,上海 200031
摘要
目的

对同位素稀释液相色谱串联质谱法(ID-LC-MS/MS)、肌氨酸氧化酶法(简称酶法)和碱性苦味酸法(简称Jaffe法)的血清肌酐检测结果进行方法比较,为临床实验室不同检测系统肌酐检测结果的一致性提供参考。

方法

采用ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法同时测定200例临床血清标本、50例溶血标本、50例高脂标本(甘油三酯1.88~17.60 mmol/L)和6例标准添加标本的肌酐水平,观察3种方法的精密度、回收率、方法偏差以及溶血和高脂对检测方法的干扰程度。

结果

血清标准添加50和100 μmol/L肌酐,酶法、Jaffe法和ID-LC-MS/MS的变异系数(CV)分别为<1.14%、<2.39%、<3.84%;回收率分别为84.9%、82.2%,74.4%、70.8%,96.1%、96.3%。ID-LC-MS/MS与酶法、Jaffe法的线性回归方程分别为Y酶法=0.964XID-LC-MS/MS+0.385,r=0.994;YJaffe法=0.955XID-LC-MS/MS+13.14,r=0.979。与ID-LC-MS/MS比较,酶法和Jaffe法的平均偏差分别为-2.93%、13.9%。溶血和高脂对酶法、Jaffe法测定血清肌酐均有不同程度的负干扰。

结论

酶法与ID-LC-MS/MS的血清肌酐测定结果可比性较好,Jaffe法的血清肌酐测定结果明显偏高。溶血和高脂可干扰酶法和Jaffe法的血清肌酐测定,使结果偏低。

关键词: 肌酐; 同位素稀释液相色谱串联质谱法; 肌氨酸氧化酶法; 碱性苦味酸法
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)08-0698-06
Methodology comparison of serum creatinine determined by isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry,enzymatic method and Jaffe method
SONG Yunxiao1, OU Meixian2, LI Shuijun2, ZHANG Haichen1, YU Chen2
1. Department of Clinical Laboratory,Shanghai Xuhui Central Hospital, Shanghai 200031, China
2. Central Laboratory, Shanghai Xuhui Central Hospital, Shanghai 200031, China
Abstract
Objective

To compare the results of the serum creatinine determined by isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry (ID-LC-MS/MS), sarcosine oxidase enzymatic method (enzymatic method) and Jaffe method, and provide the reference for concordance from different determination systems.

Methods

Serum creatinine levels in 200 clinical serum samples, 50 hemolyzed samples, 50 lipidic samples (triglyceride 1.88-17.60 mmol/L) and 6 standard serum samples were determined by ID-LC-MS/MS, enzymatic method and Jaffe method. The precisions, recoveries, relative biases and interferences to hemolysis and lipid were compared among the 3 methods.

Results

Adding 50 μmol/L and 100 μmol/L creatinine, the coefficients of variation (CV) were < 1.14%, < 2.39% and < 3.84%, the recoveries were 84.9%, 82.2%; 74.4%, 70.8% and 96.1%, 96.3% for enzymatic method, Jaffe method and ID-LC-MS/MS, respectively. Compared to ID-LC-MS/MS, the linearity regression equations of enzymatic method and Jaffe method wereYenzymatic method=0.964XID-LC-MS/MS+0.385(r=0.994) andYJaffe method=0.955XID-LC-MS/MS+13.14(r=0.979). Compared to ID-LC-MS/MS, the average relative bias of serum creatinine were -2.93% by enzymatic method and 13.9% by Jaffe method. Significant negative interferences were observed in hemolyzed and lipidic samples.

Conclusions

There is a good comparability on serum creatinine between enzymatic method and ID-LC-MS/MS. The serum creatinine level can be overestimated by Jaffe method. The serum creatinine levels can be underestimated in hemolyzed and lipidic samples by enzymatic method and Jaffe method.

Keyword: Creatinine; Isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry; Sarcosine oxidase enzymatic method; Jaffe method
引言

血清肌酐是评价肾功能的重要指标。目前临床常用的检测方法有化学法和酶法,碱性苦味酸法(简称Jaffe法)和肌氨酸氧化酶法(简称酶法)是其代表方法,但均存在不同程度的特异性和可比性等问题[ 1, 2, 3, 4],国内实验室肌酐的检测性能还有待进一步提高[ 5]。建立参考方法是解决Jaffe法和酶法肌酐检测问题的有效途径。国际上肌酐检测的参考方法采用同位素稀释气相色谱质谱法或者同位素稀释液相色谱串联质谱法(ID-LC-MS/MS)[ 6, 7, 8, 9]。我们采用自建的ID-LC-MS/MS,在方法学全面验证之后,与酶法和Jaffe法进行比较,评价现有肌酐检测方法与ID-LC-MS/MS的可比性。

材料和方法
一、 试剂和仪器

1.试剂

肌酐标准品(纯度99.8%)购自美国Sigma公司;肌酐-d3(同位素丰度98%)购自加拿大TRC公司;改良Jaffe法肌酐测定试剂盒(批号:141012017)、Jaffe法肌酐测定试剂盒(批号:141112011)、迈瑞常规生化复合校准品(批号:SM312)、迈瑞常规生化复合定值质控品(正常水平批号:050212003;病理水平批号:QMP313)均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

2.仪器

ID-LC-MS/MS采用液相色谱串联质谱系统,由Agilent 1200液相色谱仪(美国Agilent公司)和API 4000串联四极杆质谱仪(美国Applied Biosystems公司)组成。酶法和Jaffe法采用迈瑞BS-800M全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。

二、 肌酐检测方法

1.ID-LC-MS/MS

在50 μL血清中添加同位素肌酐-d3为内标,用甲醇沉淀蛋白,离心取上清液,经高效液相色谱分离,以正离子多反应监测质谱扫描分析,检测离子通道为114/86 amu(肌酐)和117/89 amu(内标)。方法的线性范围为4.4~885 μmol/L (0.5~100 μg/mL),最低定量限为4.4 μmol/L。尿毒症标本及脂血、溶血、黄疸对肌酐分析无干扰。

2.酶法

采用迈瑞BS-800M全自动生化分析仪测定,波长为546 nm,温度37 ℃,采用终点法分析类型,反应方向为上升反应。线性范围为10~9 000 μmol/L。取空白/校准品/标本6 μL,加入肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、过氧化氢酶及ESPMT混合物180 μL,混匀,37 ℃孵育5 min,测定吸光度( A1)值;再加入肌酐胺基水解酶、过氧化物酶及4-氨基安替比林(4-APP)的混合物60 μL,混匀,37 ℃孵育5 min后,测定 A2值,计算 A值的差值Δ A( ΔA=[( A2 -A1)校准品管或标本管 - ( A2 -A1)空白管]。

3.Jaffe法

采用迈瑞BS-800M全自动生化分析仪测定,波长510 nm,温度37 ℃,采用固定时间法分析类型,反应方向为上升反应。线性范围为9~2 420 μmol/L。取空白/校准品/标本18 μL,加入0.38 mol/L NaOH 180 μL,混匀,37 ℃孵育1 min;再加入15 mmol/L苦味酸180 μL,混匀,37 ℃孵育30 s后,连续测定2 min内的 A值,计算变化率(Δ A/min=Δ A/min标本管-Δ A/min空白管)。

三、 标本来源

收集上海市徐汇区中心医院门诊及住院患者血清标本共200例,其中男82例、女118例,排除明显溶血和脂浊的标本。同时收集上海市徐汇区中心医院门诊、体检中心及住院患者的临床检验剩余标本,选择明显溶血标本50例、高脂标本(甘油三酯1.88~17.6 mmol/L)50例作为干扰标本。收集临床男、女性正常血清标本各1份,分别添加50和100 μmol/L肌酐标准品,用于精密度和回收率试验。所有血清标本收集后置-70 ℃保存。

四、 精密度及回收率试验

按美国临床实验室修正法案(CLIA'88)的要求观察3种方法的精密度。批内精密度:一次性同时测定20次;批间精密度:每天2批,每批2个浓度,每个浓度检测2次,连续测定10 批。精密度以变异系数( CV)表示[ CV(%)=重复测定结果标准差/均值×100]。添加50和100 μmol/L肌酐标准品的正常血清标本和未添加肌酐标准品的正常血清标本分别用ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法重复测定6次,观察方法的回收率。回收率(%)=(添加标准品标本的血清肌酐浓度-未添加标准品标本的血清肌酐浓度)/标准品添加浓度×100。

五、 干扰试验

分别用ID-LC-MS/MS、酶法、Jaffe法测定溶血标本、高脂标本的肌酐浓度,计算酶法和Jaffe法与ID-LC-MS/MS的相对偏差。方法偏差(Bias%)=(方法1测定值-方法2测定值)/[(方法1测定值+方法2测定值)/2]×100。考察溶血和脂血对3种方法检测肌酐的影响。

六、 统计学方法

数据统计分析采用SPSS 16.0软件进行,方法之间的差异采用配对 t检验和方差分析,方法相关性采用线性回归分析。 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、 精密度及回收率

3种方法重复测定血清肌酐的批内、批间精密度及回收率结果见表1。3种方法的批内、批间 CV均<5%,回收率由高到低依次为ID-LC-MS/MS>酶法>Jaffe法,无论添加50还是100 μmol/L肌酐标准品,3种方法回收率差异均有统计学意义( P<0.005)。

表1 ID-LC-MS/MS、酶法、Jaffe法测定血清肌酐的精密度及回收率(%)
二、 相关性和偏差

采用ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法分别测定200例临床血清标本肌酐浓度,经线性回归分析,方法间的回归方程分别为 Y酶法 =0 .964 XID-LC-MS/MS+0.385, r=0.994; YJaffe法=0.955 XID-LC-MS/MS+13.14, r=0.979。ID-LC-MS/MS与酶法、Jaffe法的线性相关图见图1:

图1 ID-LC-MS/MS与酶法、Jaffe法的线性相关图

注:(a)ID-LC-MS/MS与酶法的线性相关图, Y酶法=0.964 XID-LC-MS/MS+0.385, r=0.994;(b)ID-LC-MS/MS与Jaffe法的线性相关图, YJaffe法=0.955 XID-LC-MS/MS+13.14, r=0.979

对ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法检测200例血清标本肌酐浓度进行方法之间的一致性分析。以2种方法的肌酐测定均值为横坐标,以2种方法肌酐测量值百分偏差为纵坐标,做Bland-Altman图分析酶法、Jaffe法与ID-LC-MS/MS的测定差异,见图2。酶法与ID-LC-MS/MS的平均偏差为-2.93%,偏差幅度在-26.2%~21.2%之间波动;测定偏差有浓度依赖关系,当肌酐浓度>100 μmol/L时酶法的测定结果正负偏差和波动幅度明显减小(相对偏差为-8.3%~2.4%)。Jaffe法与ID-LC-MS/MS的平均偏差为13.9%,偏差幅度在-12.6%~35.5%之间波动。与ID-LC-MS/MS相比,肌酐<100 μmol/L时Jaffe法的结果呈现明显正偏差;肌酐>100 μmol/L时Jaffe法结果与ID-LC-MS/MS基本趋于一致(相对偏差为-3.7%~14.6%)。从图2可以看出酶法与ID-LC-MS/MS的肌酐测定结果总体上呈现较小的负偏差,而Jaffe法与ID-LC-MS/MS的肌酐测定结果呈明显正偏差。

三、 干扰试验

同时用ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法测定高脂标本的血清肌酐浓度。结果显示高脂可明显干扰酶法及Jaffe法测定血清肌酐的准确性。与ID-LC-MS/MS相比,酶法及Jaffe法的测定结果均出现负偏差,见图3;酶法的平均百分偏差为-10.9%(-22.1%~13.7%),Jaffe法为-17.5%(-71.1%~16.1%)。高脂对Jaffe法的影响比酶法更大,其中有4份甘油三酯>7.0 mmol/L的标本肌酐测定结果甚至出现负值。随着甘油三酯浓度的增高,测定负偏差趋势越明显。

同时用ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法测定明显溶血标本的肌酐浓度。与ID-LC-MS/MS比较,酶法测定溶血标本肌酐浓度的相对偏差均值为-9.1%(-18.0%~11.7%),Jaffe法的相对偏差均值为-4.7%(-22.0%~20.0%)。

高脂、溶血对酶法和Jaffe法测定肌酐产生明显的负偏差,其百分偏差与正常标本比较有明显差异( P<0.001),见图4:

图2 ID-LC-MS/MS与酶法、Jaffe法的Bland-Altman图

注:(a)ID-LC-MS/MS与酶法的Bland-Altman图;(b)ID-LC-MS/MS与Jaffe法的Bland-Altman图

图3 甘油三酯浓度与酶法-ID-LC-MS/MS、Jaffe法-ID-LC-MS/MS测定肌酐百分偏差的关系

注:(a)甘油三酯浓度与酶法-ID-LC-MS/MS测定肌酐的百分偏差;(b)甘油三酯浓度与Jaffe法-ID-LC-MS/MS测定肌酐的百分偏差

图4 正常标本、高脂标本和溶血标本肌酐测定偏差比较

注:(a)ID-LC-MS/MS与酶法的百分偏差;(b)ID-LC-MS/MS与Jaffe法的百分偏差;与正常标本比较,* P<0.001

讨论

随着临床检验实验室检测项目和检测标本量的不断增加,用于临床检验的各种仪器和方法也越来越多。而不同方法之间是否具有可比性,不同医院、实验室之间检测结果能否互认仍然是摆在我国临床检验医学面前的现实难题[ 10]。而进行方法比对试验,特别是与参考标准方法进行比对,是实现检验结果一致性的重要途径[ 11]。目前临床测定血清肌酐的常用方法为酶法和Jaffe法,有很多报道表明2种方法测定肌酐存在差异[ 1, 3, 12]。同位素稀释质谱法利用在标本中添加与肌酐结构相同的稳定同位素内标,标本处理后经液相色谱仪分离,多反应监测质谱选择肌酐的母离子和子离子,检测离子信号。本研究采用自建的ID-LC-MS/MS,在方法学全面验证之后,对ID-LC-MS/MS、酶法和Jaffe法血清肌酐检测结果的可比性进行分析,为临床实验室不同检测系统肌酐检测结果的一致性提供参考。建立和应用参考方法是临床检验标准化的有效途径,参考方法经过了严格的溯源和验证,具有最高的计量学溯源性和准确性。但是参考方法对仪器设备和分析条件的要求较高,常规实验室难以实现,应用范围窄。与国际推荐的参考方法相比,本研究自建的ID-LC-MS/MS在实验室内部进行了评价和验证,并与常规方法进行了比较,简便性和适用性是其突出特点。

酶法测定血清肌酐具有良好的精密度,批内、批间 CV均<1.14%,Jaffe法的 CV可控制在2.39%以内。相对酶法和Jaffe法,ID-LC-MS/MS需要进行标本前处理,但 CV可控制在3.84%以内。可见3种方法分析精密度完全满足临床血清肌酐检测的要求。在正常血清中添加2个浓度水平的肌酐标准品,测定肌酐的回收率,平均回收率由高到低分别为ID-LC-MS/MS>酶法>Jaffe法,表明ID-LC-MS/MS在降低基质干扰、提高分析准确性上优于其他2种方法。

总体而言,酶法、Jaffe法肌酐结果与ID-LC-MS/MS具有良好的相关性。从相关系数和线性斜率上看,酶法与ID-LC-MS/MS的相关性要优于Jaffe法与ID-LC-MS/MS的相关性。除个别低浓度标本外,酶法与ID-LC-MS/MS具有较好的一致性,而Jaffe法对ID-LC-MS/MS的截距为13.14 μmol/L,呈明显的正偏差,主要集中在低浓度区域(肌酐<100 μmol/L)。究其原因可能还是存在特异性的问题,血清基质中某些物质干扰Jaffe法肌酐的检测。虽然ID-LC-MS/MS的线性范围为4.4~885.0 μmol/L,比酶法和Jaffe法窄,仍可覆盖临床上所有正常人的血清肌酐以及绝大多数病理状态(如尿毒症)下的血清肌酐浓度范围。本研究收集了200例临床标本,血清肌酐范围为31~365 μmol/L,在ID-LC-MS/MS的线性范围内,因此3种方法的比较基本反映了真实情况。

酶法和Jaffe法测定肌酐均为间接检测法,易受内源性物质的干扰,而Jaffe法的抗干扰能力更弱[ 3, 4]。ID-LC-MS/MS为直接检测法,由于经过标本净化处理和液相色谱分离步骤,可以最大限度地避免与干扰物共流出,减少标本基质效应,再由串联质谱仪检测肌酐的母离子和碎片离子,具有极高的检测特异性和抗干扰能力。采用同位素稀释法可以最大程度地减少分析过程中的损失和误差,具有极高的检测准确性。因此ID-LC-MS/MS常被推荐作为临床肌酐参考测量方法[ 7, 8, 13]。本研究发现高脂和溶血对酶法和Jaffe法肌酐测定有明显干扰,影响肌酐测定的准确性。与ID-LC-MS/MS相比,高脂、溶血对酶法和Jaffe法的肌酐测定产生明显负偏差。高脂可使Jaffe法的肌酐测定偏差明显增大。因此在临床常规检验中,采用Jaffe法或者酶法检测肌酐,若发现标本为高脂或溶血状态,应当谨慎对待检测结果。如有条件,建议用ID-LC-MS/MS复核可疑数据。

总之,ID-LC-MS/MS测定血清肌酐在准确性和抗干扰能力方面具有一定的优势。酶法与同位素稀释质谱法的血清肌酐测定结果具有较好的可比性,受干扰影响小。Jaffe法的血清肌酐测定结果则存在较大偏差,更加易受干扰影响。

The authors have declared that no competing interests exist.

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