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丁柳美, 黄红梅, 高松, 邬扬炯, 李莹, 化范例. 骨髓增生异常综合征患者SALL4和Nanog的表达及其临床意义 . 2013, 28(8): 681-684[DING Liumei, HUANG Hongmei, GAO Song, WU Yangjiong, LI Ying, HUA Fanli. Expressions ofSALL4 andNanog in patients with myelodysplastic syndrome and their clinical significance . 上海检验医学, 2013, 28(8): 681-684]  
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骨髓增生异常综合征患者SALL4和Nanog的表达及其临床意义
丁柳美1, 黄红梅1, 高松2, 邬扬炯2, 李莹2, 化范例2
1.复旦大学附属金山医院检验科,上海 201508
2.复旦大学附属金山医院血液科,上海 201508
摘要
目的

探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者外周血及骨髓SALL4 mRNA和Nanog mRNA表达及其临床意义。

方法

运用逆转录聚合酶链反应(PCR)检测75例MDS患者外周血和骨髓及30名正常对照者外周血有核细胞SALL4 mRNA和Nanog mRNA表达,并比较各亚型MDS之间的表达差异。

结果

MDS患者外周血及骨髓SALL4 mRNA表达均明显高于正常对照(χ2=22.92,P<0.01),骨髓标本表达明显强于外周血标本(Z=5.60,P<0.01);Nanog mRNA表达亦高于正常对照(F=88.78,P<0.01),但在骨髓中的表达与外周血相仿(t=0.898,P=0.371);SALL4 mRNA与Nanog mRNA表达在MDS各亚型之间差异有统计学意义(P<0.01),以RAEB-Ⅰ和RAEB-Ⅱ 2个亚型患者表达最强。7例转化为急性髓性白血病的MDS患者外周血和骨髓SALL4 mRNA和Nanog mRNA的表达均高于其他MDS患者(SALL4 mRNA外周血t=2.27,P<0.05;骨髓t=2.85,P<0.05。Nanog mRNA外周血t=5.20,P<0.01;骨髓t=5.51,P<0.01)。

结论

MDS患者外周血和骨髓高表达SALL4 mRNA和Nanog mRNA,其表达高、低与MDS转归有一定的相关性。

关键词: SALL4mRNA; Nanog mRNA; 骨髓增生异常综合征
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)08-0681-04
Expressions ofSALL4 andNanog in patients with myelodysplastic syndrome and their clinical significance
DING Liumei1, HUANG Hongmei1, GAO Song2, WU Yangjiong2, LI Ying2, HUA Fanli2
1. Department of Clinical Laboratory, Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201508, China
2. Department of Haematology, Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201508, China
Abstract
Objective

To investigate the expressions ofSALL4 mRNA andNanog mRNA in peripheral blood and bone marrow in patients with myelodysplastic syndrome(MDS) and their clinical significance.

Methods

The reverse transcription polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the expressions ofSALL4 mRNA andNanog mRNA in the peripheral blood and bone marrow of 75 patients with MDS and the peripheral blood of 30 healthy controls. The difference of the expressions between MDS subtypes was analyzed.

Results

The expression ofSALL4 mRNA in peripheral blood and bone marrow of patients with MDS was significantly higher than that in healthy controls(χ2=22.92,P<0.01). The higher expression ofSALL4 mRNA was found in bone marrow than peripheral blood(Z=5.60,P<0.01). The expression ofNanog mRNA was higher in patients with MDS than healthy controls(F=88.78,P<0.01), but there was no difference between peripheral blood and bone marrow(t=0.898,P=0.371). There were statistical significance ofSALL4 andNanog mRNA among MDS subtypes(P<0.01), especially RAEB-Ⅰ and RAEB-Ⅱ. In 7 patients who evolved into acute myeloblastic leukemia,the expressions ofSALL4 mRNA(peripheral bloodt=2.27,P<0.05; bone marrowt=2.85,P<0.05) andNanog mRNA(peripheral bloodt=5.20,P<0.01; bone marrowt=5.51,P<0.01) were significantly higher than the others.

Conclusions

SALL4 mRNA andNanog mRNA are over-expressed in patients with MDS,and the expression correlates with the clinical outcomes.

Keyword: SALL4 mRNA; Nanog mRNA; Myelodysplastic syndrome
引言

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome, MDS)是一组获得性造血干细胞克隆性疾病,以血细胞减少及病态造血为特点,但MDS异质性非常明显,大部分患者呈现慢性、良性的病程,而高危患者可转化为急性白血病,预后极差。促进MDS转化为急性白血病的机制未明,近年来研究表明,同源异型基因 SALL4表达失衡可增加CD34+造血干细胞/祖细胞的增殖能力而促进白血病的发生[ 1],另外一种干细胞转录因子Nanog则抑制p53表达并与正常细胞向肿瘤细胞转化有关[ 2, 3]。MDS作为“白血病前期”,造血干细胞具有不断演变的特点,本研究对各亚型MDS患者外周血及骨髓有核细胞 SALL4 mRNA和 Nanog mRNA的表达情况进行了检测,以初步探讨MDS患者 SALL4 mRNA和 Nanog mRNA表达的临床意义。

材料和方法
一、标本来源

标本来源于复旦大学附属金山医院肿瘤血液中心2007年6月至2012年6月收治的75例MDS患者。所有患者均经细胞形态学、免疫学、遗传学或分子生物学确诊,按2008年第4版《WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues》重新确认分型,其中难治性血细胞减少伴单系病态造血(RCUD)11例,难治性贫血伴环状铁粒幼红细胞(RAS)2例,难治性血细胞减少伴多系发育异常(RCMD)29例,难治性贫血伴原始细胞增多(包括RAEB-I和 RAEB-II)28例,不能分类者(MDS-U)5例。男41例,女34例,年龄21~76岁。对照组30名,男18名,女12名,年龄31~59岁,为健康体检人群。

二、试剂和仪器

Trizol试剂为美国Invitrogen公司产品,红细胞裂解液购自无锡碧云天生物试剂公司,Prime-Script RT逆转录试剂盒及SYBR Premix Ex Taq荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)试剂盒均购自日本Takara公司,荧光定量PCR仪为德国Eppendorf公司产品(MasterCycler Realplex4 system)。引物由Invitrogen公司合成。

三、外周血和骨髓标本制备

外周血标本:抽取静脉血2 mL,置经乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acide, EDTA)处理的15 mL无酶离心管内;骨髓标本:抽取2~3 mL骨髓,立即置经EDTA处理的15 mL无酶离心管内。于30 min内进行以下操作:在离心管内加入3 mL红细胞裂解液,轻轻振荡混匀后静置10 min,室温470× g离心5 min,弃上清。重复裂解红细胞1次,加入1 mL Trizol试剂置-70 ℃保存以备提取总RNA。

四、 总RNA抽提、逆转录PCR

采用Trizol-氯仿-异丙醇方法提取标本总RNA,所提取的总RNA经紫外分光光度仪测定总RNA含量及260和280 nm处吸光度( A)值,260和280 mm A值在1.80以上者用于后续试验。每份标本取总RNA 1 μg,按照产品操作说明,以20 μL体系逆转录为cDNA。

荧光定量PCR:登陆GenBank查询 SALL4 cDNA序列,根据引物设计原则设计各目的基因扩增引物, SALL4上游引物5'-CAGCACATCAACTCGGAGGAGGAGG-3',下游引物5'-ACTCAGAGATGCTGAAGAACTC-3',扩增产物282 bp; Nanog上游引物5'-CAGCTGTGTGTACTCAATGATAGA-3',下游引物5'-ACACCATTGCTATTCTTCGGCCAG- 3',扩增产物179 bp;内参GAPDH上游引物5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3',下游引物5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3',扩增产物127 bp。反应条件为95 ℃ 30 s 预变性,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40个循环。反应体系为20 μL,每份标本均设3孔检测。

五、统计学方法

使用SPSS 16.0软件进行统计分析。mRNA表达变化以ΔΔCt作为统计量,符合正态分布和方差齐性的数据2组内比较采用独立样本 t检验,多组内比较采用单因素方差分析,不符合正态分布和方差齐性的数据则进行秩和检验。分类资料比较采用 χ2检验。 SALL4 mRNA和 Nanog mRNA表达(ΔΔCt)关系进行线性相关分析。 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、MDS患者 SALL4 mRNA和 Nanog mRNA表达

30名正常对照外周血有核细胞均无 SALL4表达,75例MDS患者中,39例外周血有不同强度的 SALL4表达,有36例 SALL4不表达。MDS患者 SALL4 表达明显高于正常对照( χ2=22.92, P<0.01)。MDS患者骨髓标本的 SALL4表达明显高于外周血标本( Z=5.60, P<0.01),所有MDS患者骨髓中均可见 SALL4表达。75例MDS患者及正常对照外周血均可见 Nanog表达,但各亚型MDS患者表达明显高于正常对照( F=88.78, P<0.01)。而且,MDS患者 Nanog在骨髓中的表达水平与外周血基本相仿( t=0.898, P=0.371),见图1:

图1 MDS患者 SALL4 mRNA和 Nanog mRNA的表达

二、MDS各亚型之间 SALL4 mRNA和 Nanog mRNA的表达

MDS各亚型之间在外周血和骨髓中的 SALL4与 Nanog表达均有明显差异,见图2。其中外周血有核细胞 SALL4的表达几乎均局限于RAEB-Ⅰ和RAEB-Ⅱ 2个亚型,其余亚型少见表达( χ2=43.59, P<0.01);骨髓中 SALL4表达在各亚型之间同样差异明显( F=15.98, P<0.01);外周血和骨髓中 Nanog的表达在不同MDS亚型患者之间均差异明显(外周血 F=27.47, P<0.01;骨髓 F=23.92, P<0.01),以RAEB-Ⅰ和RAEB-Ⅱ 2个亚型患者表达最强。另外, SALL4 与 Nanog在骨髓中的表达呈现一定的相关性( r=0.58, P<0.01)。

图2 SALL4 mRNA和 Nanog mRNA在MDS各亚型之间的表达

三、 SALL4 mRNA和 Nanog mRNA表达与MDS的转归

75例MDS患者中,共有7例患者转化为急性髓性白血病,其中5例为 RAEB-Ⅱ亚型,1例为RAEB-Ⅰ亚型,另外1例为RCMD亚型。虽然例数较少,但这些患者无论是外周血还是骨髓,其 SALL4 mRNA和 Nanog mRNA的表达均高于其他患者( SALL4 外周血 t=2.27, P<0.05;骨髓 t=2.85, P<0.05。 Nanog外周血 t=5.20, P<0.01;骨髓 t=5.51, P<0.01)。

讨论

原癌基因 SALL4是一类在进化过程中高度保守的基因。在正常骨髓CD34+造血干细胞/祖细胞中表达,而随原始细胞的分化成熟,其表达下调,对维持胚胎干细胞的多向潜能和自我更新有着重要作用[ 2]。 SALL4作为调节生长发育的转录因子,可与其他造血调控因子共同作用于造血过程,影响白血病的发生和发展。本研究对 SALL4与血液病中MDS的关系进行了初步研究,结果显示MDS患者 SALL4 表达明显高于正常对照,但有部分患者外周血始终未能诱导出 SALL4 表达,而患者骨髓中则均表达 SALL4且明显高于外周血标本。由此可见, SALL4在外周血表达量较小,而骨髓由于含有较多的造血干细胞,对 SALL4检测的敏感性明显增高。Lin等[ 3]最新的研究表明,MDS患者 SALL4表达的升高可能源于基因的低甲基化。

2003年,Chambers等[ 4]和Mitsui等[ 5]几乎同时报道了一种在囊胚内细胞群、原始生殖细胞以及ESCs表达的新转录因子,将该基因命名为 Nanog。 Nanog除了有助于胚胎干细胞自我更新和维持其未分化状态,还可促进细胞增殖[ 6]。 Nanog在癌细胞中的表达及其与p53之间的相互作用提示 Nanog的表达与体细胞向癌细胞转化有关[ 7]。我们通过对 Nanog在MDS中的变化以及其在疾病不同状态下的表达研究,发现虽然 Nanog的表达方式与 SALL4有所区别,但其表达亦明显高于正常对照,表明 Nanog和 SALL4在MDS的发生、发展中同样密切相关。 SALL4 与 Nanog在骨髓中的表达量呈现一定的相关性,提示在MDS疾病的发展过程中, SALL4 与 Nanog具有同步变化的特点,二者可能共同参与了促进造血干细胞恶变的机制。

无论是在外周血和骨髓中, SALL4 和 Nanog的表达在MDS各亚型之间均存在明显差异:RAEB-I和RAEB-Ⅱ 2个亚型中 Nanog和 SALL4的表达明显高于其他亚型,这与RAEB-I和RAEB-II亚型体内原始细胞数量明显升高相一致。王华等[ 8]运用逆转录PCR已经证实急性白血病患者高表达 SALL4,其中以急性髓性白血病患者表达更为明显,而本研究相应地发现,在7例转化为急性髓性白血病的MDS患者中,其确诊MDS时的外周血及骨髓的 SALL4和 Nanog表达明显高于其他患者,提示MDS患者中 Nanog和 SALL4的表达可能从另外一个侧面反映白血病细胞的负荷,对疾病的转归具有一定的预测意义。 SALL4和 Nanog均与正常造血干细胞向白血病干细胞转化密切相关,二者是否具有协同作用有待于进一步研究。深入了解 SALL4和 Nanog的作用将有助于探讨MDS的发病机制及其各亚型之间在分子生物学水平上的差别,并为今后更准确地诊断和靶向治疗恶性血液病提供潜在的新途径。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[6] Chambers I, Colby D, Robertson M, et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells[J]. Cell, 2003, 113(5) : 643-655. [本文引用:1] [JCR: 31.957]
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