钙离子(Ca²⁺)是细胞信号传导过程中重要的第二信使,在细胞内传递信息并调控一系列生命过程。当细胞受到相应刺激时,细胞会通过各种途径升高细胞内Ca²⁺浓度,胞浆内Ca²⁺浓度的升高主要来源于2个方面:外钙内流和细胞内钙库释放。外钙内流的途径主要分成3大类:电压门控的钙通道(voltage depentent calcium chnnel, VOC)、受体门控的钙通道(receptor operated calcium chnnel, ROC)和库操纵性钙通道(store-operated calcium channels,SOC)。VOC和ROC的特性是在短时间内产生大量的钙内流,SOC 则产生较小的、持续的钙内流。细胞膜上持续的钙内流保证了信号的正常传播。目前认为,瞬时受体电位C(TRPC)通道家族成员是构成细胞膜上SOC和ROC的分子基础。

瞬时受体电位通道(TRP)基因首次发现于黑腹果蝇的视觉传导系统中,突变体果蝇对持续的光刺激只产生瞬时而非持续的锋电位,因而得名。迄今已在果蝇、蠕虫以及哺乳动物等生物体先后发现了多种TRP通道。依据氨基酸序列的同源性,将TRP通道分为7个亚族^{[ 1]},分别为TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP、TRPML、TRPN。 TRP通道与电压依赖性阳离子通道类似,具有6次跨膜(S1-S6)结构域,以及位于胞内的N末端和C末端。TRP通道的S5与S6之间的片段内嵌构成离子通过孔道,因S4片段缺乏通常电压依赖性阳离子通道S4片段所具有的正电荷氨基酸残基,所以 TRP通道属于非电压依赖性的离子通道,主要通过的离子为Ca²⁺与钠离子(Na⁺),几乎所有的功能性TRP通道都对Ca²⁺具有通透性。

TRP作为细胞重要的感受器,传递细胞内、外的信息,对来自细胞内、外环境的物理和化学等多种刺激信号产生反应,以维持细胞的生存和参与细胞的众多基本生理活动,同时也受来自细胞内、外的信使分子、化合物以及温度、渗透压等变化的调节。TRP参与的功能主要包括温度和疼痛感觉(TRPVI、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8和TRPAI亚家族)、机械感觉(TRPV2、TRPV4、TRPM3、TRPA1、TRPP1、TRPP2、TRPML3和 TRPC1亚家族)、味觉(TRPM5、TRPP2亚家族)、维持细胞离子稳态(TRPV5、TRPV6、TRPM6和TRPM7亚家族)、参与细胞生长调控(TRPM亚家族)以及介导磷脂酶C(PLC)依赖的钙内流(TRPC亚家族)。

1.TRPC通道的结构和分型 TRPC即传统型TRP通道,该亚家族与果蝇的TRP通道同源性最高,故得名。TRPC是瞬时受体电位通道家族中最早发现的成员,具有TRP通道普遍的结构特征,属于非电压依赖性的离子通道。TRPC亚家族包括TRPC1~7共7个亚型,其中TRPC2 在人类是伪基因,只表达于大鼠和小鼠。根据氨基酸序列同源性及功能相似性,TRPC通道分为4类:TRPC1 、TRPC2 、TRPC3/6/7和TRPC4/5。大量研究结果提示,功能性TRPC通道是由相同或不同亚型组成的四聚体组成。TRPC四聚体孔道区具有高度保守性,该区域的定向诱变可导致通道活性丧失^{[ 2]}。

2. TRPC通道的分布和功能 TRPC亚家族不同成员分布不同,通道激活后发挥的功能亦不同。TRPC1分布很广,在脑、心脏、肾脏、肺、骨骼肌、前列腺、皮肤、睾丸和卵巢都存在高水平表达。作为最早被发现的哺乳动物TRP 通道,TRPC1主要的功能为参与受体介导的、钙依赖的分泌和收缩过程;TRPC2在人类是伪基因,在小鼠可能作为信息素感受体以及参与精子顶体反应;TRPC3主要分布于脑、胎盘、心脏、骨骼肌和平滑肌,参与脑源性神经生长因子(BDNF) 介导的神经分化、血管收缩和抗原刺激引起的淋巴细胞免疫反应。曾有报道^{[ 3]}TRPC3和另一种重要的钙调节器,钠钙交换体(NCX)偶联,Na⁺通过TRPC3通道进入细胞内,激活NCX的逆向转运,从而使细胞内Ca²⁺浓度增加;TRPC4主要分布于脑、睾丸、胎盘、肾上腺和内皮细胞,参与血管收缩、微血管渗透以及外侧膝状体γ-氨基丁酸(GABA)能神经的输入。TRPC4基因被敲除的小鼠呈现出主动脉内皮细胞的钙内流消失,一氧化氮(NO)合成受损,以及血管舒张功能减退。在肺血管内皮细胞中,表现为钙内流减弱,微血管通透性降低。TRPC5主要分布于脑、肺、睾丸和胎盘,可能与生长锥的形成和脑的发育有关。TRPC6分布于肺、心脏、脑和肌肉,可能参与血管收缩和血小板聚集。TRPC7主要分布于心脏、肺、眼、脑、脾脏和睾丸,现在对其参与的功能还尚未明确。

3. TRPC通道激活机制 TRPC通道的激活受多种因素的调节,包括渗透压、pH 值、机械力及一些内、外源性配体和细胞内信号分子。尽管目前TRPC通道的激活机制还存在某些争议,但能被磷脂酶C(PLC)偶联的膜受体激活已被证实。TRPC通道主要激活机制可归纳为以下:内、外源性配体和细胞内信号分子分别作用于G蛋白偶联受体和受体酪氨酸激酶偶联受体,激活PLC β和γ ,PLC激活后水解4,5二磷酸磷脂肌醇(PIP2),生成肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG),细胞内IP3水平的升高使IP3敏感的钙库释放Ca²⁺。当钙库耗竭,促使细胞膜 TRPC通道激活,继而引发Ca²⁺流入细胞内填充钙库。此外,保留在细胞膜上的DAG也可直接激活TRPC通道。根据激活机制的不同, TRPC通道大致可分为两类:(1)TRPC 1/4/5:具有SOC特性,在细胞内钙池耗竭时被激活;(2)TRPC 3/6/7:表现出受体操纵性钙通道特性,可由DAG及其代谢产物直接激活。另外,TRPC 3/6具有库操纵性钙通道和受体操纵性钙通道双重特性,在不同条件下表现出不同的特性^{[ 4]}。

4. TRPC 通道与钙库操纵性钙通道 1986年,Putney^{[ 5]}首先描述了一种依赖钙库耗竭激活Ca²⁺内流的现象:当细胞外刺激物活化细胞膜G蛋白耦联受体或酪氨酸激酶受体后,细胞内PLC信号途径被激活导致钙库释放Ca²⁺,钙库耗竭;此时细胞膜上的钙通道被激活并产生持续性Ca²⁺内流,并将其称为库容性钙内流(capacitative calcium entry,CCE),被激活的细胞膜钙通道则被称为SOC。这种Ca²⁺内流方式被称为库操纵性钙内流(store-operated calcium entry,SOCE)。由上述受体蛋白信号转导途径所致的细胞内Ca²⁺呈双相性升高,先是快速短暂升高,这是Ca²⁺从内质网中释放所致;在达到峰值后又逐渐下降,并持续维持在较高的水平,形成平台期,这是由SOCE所致。几乎所有的TRPC亚型通道都可通过PLC信号途径被激活。因此,可以认为TRPC通道此时起着SOC的作用。

5. TRPC 通道参与细胞Ca²⁺的调节 相关研究表明^{[ 6]},TRPC1 和 TRPC4 参与或部分参与 SOCE 的形成。基因敲除模型的研究为 TRPC1 参与SOCE提供了依据^{[ 7]}。在 TRPC1/4 阳性细胞系中,PLC 介导或通过药物(如毒胡萝卜素)作用后引起细胞内钙池中Ca²⁺外流,Ca²⁺损耗后可以增加 SOCE;但通过SiRNA 或药物阻断剂沉默、阻断 TRPC1/4 后,SOCE的形成明显减少。另有研究显示^{[ 8]},基因敲除内皮细胞的 TRPC1 或 TRPC4 后并不影响SOCE。来自 TRPC4基因敲除小鼠模型的数据显示:TRPC4-/-小鼠主动脉内皮细胞及新生小鼠肺血管内皮细胞中,SOCE 较野生小鼠明显减少,这表明TRPC4是SOC的重要组成部分。然而,TRPC4 参与 SOCE 也同样受到质疑,有学者认为^{[ 9]},TRPC4的激活并不依赖钙池的损耗而产生 SOCE,对于TRPC1/4与SOCE的关系或许由于细胞类型的不同而存在不同的该内流调节机制,因此,这些分歧还有待进一步的研究。人类细胞中TRPC2是含有6个突变位点的假基因,而在啮齿动物中,关于TRPC2与SOCE的关系则有不同的观点。有报道显示非变异TRPC2在中国仓鼠卵巢及睾丸精原细胞中参与SOCE的形成^{[ 10]}。TRPC3在脑组织中表达丰富,有观点^{[ 11]}认为TRPC3是由受体依赖PLC活化后的信号(如DAG)直接激活,即ROC;Kiselyov等^{[ 12]}的观点则与之相反,他们认为TRPC3的活化开放依赖于钙库操纵,即SOC。而来自Vazqucz等^{[ 13]}的研究发现,TRPC3参与SOCE或ROCE取决于其表达水平,在低表达水平时,TRPC3具有SOC的功能;反之则具有ROC的功能。TRPC5主要在中枢神经系统中表达,大多数证据表明TRPC5是由受体活化 PLC-DAG传导通路激活开放,并非由钙池调节。但是在单个细胞水平的研究^{[ 14]}中,TRPC5也会以钙池操纵性钙内流的方式参与调节细胞内Ca²⁺浓度,这可能与TRPC5表达水平对钙池的敏感性有关。有研究^{[ 11]}显示,TRPC6是以受体偶联PLC-DAG方式激活参与ROCE,并非 SOCE。但是在肺动脉高压的研究中,肺动脉平滑肌(PASMCs)中TRPC6参与SOCE引起[Ca²⁺]增加,PASMCs 收缩力增强。同时TRPC6 引起的钙内流也参与细胞除极,细胞内压升高也会引起血管收缩作用。在肝癌细胞系(Huh-7、HepG-2)的研究^{[ 11]}中发现肝癌细胞仅表达TRPC1和TRPC6,SOCE的增加与TRPC6呈正相关,而与TRPC1无相关性。在HEK293细胞的研究^{[ 11]}发现,TRPC7的激活方式与蛋白表达水平相关,这一点与TRPC3相似。瞬时转染实验表明TRPC7激活方式依赖于受体偶联PLC-DAG传导通路;而当其表达水平稳定时则出现钙库操纵的激活方式。

6. TRPC通道与基质交感分子蛋白1(STIM1)、钙释放激活钙调节蛋白1(CRACM1,即Orai1) 在STIM1和Orai1被发现之前,TRPC通道被认为是SOC的单一分子基础。1992年,Hoth和Penner^{[ 15]}用膜片钳技术成功地将SOCE以电流的形式在肥大细胞(mast cell)上检测到并将其命名为钙释放激活钙离子通道(Ca²⁺release-activatedcd charmel,CRAC)。CRAC是一种典型的SOC通道,其结构和激活与Orai1、STIM1密切相关。SOC主要是由TRPC蛋白形成的同源或异源四聚体与STIM1、Orai1共同组成。STIM1是一种存在于内质网上的钙结合蛋白,可将内质网钙离子负载信息传递给钙库操纵性钙通道,对TRPC通道具有调控作用 。STIM1由685个氨基酸构成,N端位于内质网内,含有1个EF-hand结构和1个SAM结构域。C端位于细胞质中,包括卷曲螺旋区,丝氨酸、脯氨酸富集区和赖氨酸富集区。EF-hand结构是STIMl结合Ca²⁺的部位,也是STIM1作为感受器的区域^{[ 16]},能感受内质网腔内Ca²⁺浓度下降;其他的结构域,如SAM结构域、C端的卷曲螺旋区、脯氨酸和赖氨酸富集区在STIM1 颗粒的转位及激活胞膜上的TRPC通道过程中起着重要的作用^{[ 16]}。研究^{[ 17]}表明,STIM1能调节除TRPC7外其余TRPC亚族的活性,从而影响SOC的功能。STIM1可直接调节 TRPC1/4/5的功能,使其表现出SOC的作用,TRPC3/6与TRPC1/4结合组成TRPC通道异源四聚体后,可间接受STIM1调节,表现出SOC的功能。Orai1是一种位于细胞膜的高选择性钙离子通道蛋白,是构成CRAC通道的亚基。Orai1是在采用基因连锁分析检测严重联合免疫缺陷(SCID)患者基因突变时首次被发现的。Orai1包括4个跨膜片段,其N端和C端都位于细胞内,第1个和第3个跨膜片段上存在Ca²⁺结合位点,所以具有Ca²⁺选择性,其他离子很难从该通道进入细胞。Orai1与TRPC同样位于细胞膜,共同形成CRAC的“门户”,而位于内质网膜的STIM1分子是开启这扇门的“钥匙”^{[ 18]},STIM1和Orai1之间的相互作用对于CRAC通道的开启和关闭有重要意义。研究^{[ 19]}表明,Orai1可以同TRPC形成同源/异源复合体介导或者调节SOCE。除TRPC2外,TRPC家族其他成员间均可相互结合或与Orai蛋白结合组成SOC。当细胞内钙库中Ca²⁺减少到一定程度时,STIM1感受到此变化,聚合后向质膜移动,并与细胞膜上的TRPC通道、Orai1蛋白相互作用,引起胞外Ca²⁺内流,从而补充胞浆和钙库中的Ca²⁺,维持细胞的兴奋性。

作为钙库操纵性钙通道和受体操纵性钙通道的分子基础,功能性TRPC通道可介导钙库控制的Ca²⁺内流,进而参与多种疾病的病理生理过程。有研究^{[ 20, 21]} 发现,TRPC家族参与调控肿瘤的生长、侵袭、转移过程,与某些中枢神经系统疾病的发生和发展相关^{[ 22]},且在原发性高血压和心肌细胞凋亡中也有一定的作用^{[ 23]}。据报道^{[ 24, 25]},TRPC6的功能异常可导致局灶性节段性肾小球硬化,并产生蛋白尿,最终进展至慢性肾功能衰竭;也可引起 PASMCs 增殖活性增强参与特发性肺动脉高压(IPAH)的形成,并且与心肌肥大有关。

TRPC通道通过调控Ca²⁺内流影响机体的生理机能。在静息生理状态下,细胞内Ca²⁺浓度总是保持在极低的水平,其浓度的变化会影响机体的多种功能。因此,通过检测TRPC蛋白的变化来协助诊断治疗与此相关的疾病还是有一定意义的。更进一步的研究就是寻找TRPC的选择性抑制剂,从而开发一类新型的钙通道阻滞剂。目前电生理检测和分子生物学基因敲除等仍然是研究TRPC蛋白最有效的方法,逆转录PCR与蛋白免疫印迹法也同样广泛运用在TRPC的检测中。由于该领域的研究还刚展开不久,目前尚缺乏快速检测TRPC蛋白变化的手段,此类方法虽然还有待发展,但已具有广阔的应用价值。近年来Ca²⁺荧光探针的出现,可直接测定细胞内Ca²⁺的浓度^{[ 26]}。

目前与TRPC通道相关的研究主要是围绕基因缺陷性动物模型或抑制其在细胞中的表达来进行。大多数研究结果表明,抑制TRPC通道表达或使用阻滞剂可使细胞内Ca²⁺浓度降低,TRPC通道通过调控SOCE影响机体的生理机能。因此,TRPC通道阻滞剂有望成为一类新型的钙通道阻滞剂。这为预防和治疗相关疾病提供新的思路。随着研究的深入,TRPC通道的更多功能也将会被人们逐渐认识。