大肠埃希菌是临床常见的条件致病菌,也是重症监护病房(ICU)感染的主要病原菌之一。近年来,随着抗生素的广泛使用,产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌日益增多。ESBLs由质粒介导,易在种属甚至不同种属细菌间传递造成暴发流行^{[ 1]}。这一现象已成为医院感染的突出问题。氨基糖苷类抗菌药物(aminoglycosides,AGs)是一种治疗革兰阴性菌感染的重要抗菌药物。细菌对该类药物耐药主要是通过产氨基糖苷类修饰酶(AMEs)。我们收集了ICU分离的82株大肠埃希菌,通过ESBLs检测、体外药敏试验和 AMEs基因携带情况分析,了解ICU大肠埃希菌产ESBLs感染发生率,探讨产ESBLs株AGs耐药和 AMEs基因之间的关系,以期为临床合理选用抗菌药物提供理论依据。

1.菌株来源 82株大肠埃希菌临床分离株(不含同一病例相同部位的重复分离株)来自宁波市第二医院2011年1月至2012年7月期间ICU住院患者,其中痰标本20份、尿标本26份、分泌物标本21份、脓液标本11份、静脉导管标本4份。药敏质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922(购自卫生部临床检验中心)。

2.仪器与试剂 VITEK全自动微生物分析系统、M-H琼脂培养基、LB培养基购自法国BioMerieux公司;药敏纸片购自英国Oxoid公司;5418型低温离心机为Eppendorf公司产品;PowerPAC3000型电泳仪、Gel Doc XR凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品;聚合酶链反应(PCR)试剂购自大连宝生物公司。

3.ESBLs表型确证试验^{[ 2]} 参照美国临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的纸片确证扩散法标准进行,将头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸、头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸纸片贴在涂有待测菌的培养基上孵育,对2组中任何一个药物加与不加克拉维酸的抑菌圈直径差值≥5 mm时,可确证该菌株产ESBLs。

4.体外药物敏感试验 采用Kirby-Bauer纸片扩散法测定82株大肠埃希菌对6种AGs的敏感性。药敏结果均按照2011年美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准判定。

5.PCR检测产ESBLs大肠埃希菌 AMEs基因 PCR扩增模板制备:挑纯培养菌落少许置入0.5 mL离心管内,加入200 μL双蒸水,置100 ℃水浴10 min,12 000× g低温离心30 s。上清液即为基因检测的模板液。-20 ℃冰箱保存备用。引物设计根据 aac(3)-Ⅰ、 aac(3)-Ⅱ、 aac(6’)- Ⅰ、 aac(6’)-Ⅱ、 ant(2")-Ⅰ和 ant(3")-Ⅰ基因序列并参照文献^{[ 3]},由大连TakaRa公司合成,见 表1。内参照基因为GAPDH[5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’ (sense),5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(antisense)];扩增产物长度为452 bp。PCR扩增体系:10×PCR Buffer 2.5 μL;2.5 mmol/L dNT 2.5 μL;上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL;HS Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL;dH₂O 16.8 μL;DNA(50 mg/L)2.0 μL;总体积为25.0 μL。反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s,共35个循环;最后72 ℃延伸5 min。取PCR扩增产物10 μL进行3%琼脂糖凝胶电泳。

表1

表1

表1 氨基糖苷类修饰酶基因引物序列 基因名称 引物序列 产物长度(bp) aac(3)-Ⅰ 上游引物 5’-ACCTACTCCCAACATCAGCC-3’ 169 下游引物 5’-ATATAGATCTCACTAGGCGC-3’ aac(3)-Ⅱ 上游引物 5’-ACTGTGATGGGATACGCGTC-3’ 237 下游引物 5’-CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA-3’ aac(6’)-Ⅰ 上游引物 5’-TATGATGGCTAAATCGA-3’ 394 下游引物 5’-CCCGCTTTCTCGTATCA-3’ aac(6’)-Ⅱ 上游引物 5’-TTCATGTCCGCGAGCACCCC-3’ 178 下游引物 5’-GACTCTTCCGCCATCGGTCT-3’ ant(2")-Ⅰ 上游引物 5’-GAGCGAAATCTGCCGCTCTGG-3’ 320 下游引物 5’-CTGTTACAACGGACTGGCCGC-3’ ant(3")-Ⅰ 上游引物 5’-TGATTTGCTGGTTACGGTGAC-3’ 284 下游引物 5’-CGCTATGTTCTCTTGCTTTTG-3’

表1 氨基糖苷类修饰酶基因引物序列

6.统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件,率的比较采用 χ²检验。 P<0.05表示差异有统计学意义。

1.产ESBLs大肠埃希菌检测结果 82株大肠埃希菌中检出产ESBLs菌株43株,检出率为52.4%。

2.产ESBLs菌株对AGs的耐药特点 43株产ESBLs菌株有40株(90.7%)对AGs耐药。产ESBLs和不产ESBLs菌株对6种AGs的耐药率见 表2。庆大霉素、链霉素、卡那霉素和妥布霉素的耐药率在产ESBLs和不产ESBLs菌株之间差异有统计学意义( P<0.05)。

表2

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表2 产ESBLs与不产ESBLs大肠埃希菌AGs耐药情况比较 [例(%)] 菌株 株数 庆大霉素 链霉素 卡那霉素 妥布霉素 阿米卡星 奈替米星 产ESBLs 43 33(76.74) 30(69.77) 23(53.48) 27(62.79) 4 (9.30) 6 (13.95) 不产ESBLs 39 16(41.01)* 15(38.46)* 12(30.76)* 13(33.30)* 5 (12.82) 4 (5.13) 注:与产ESBLs菌株比较,* P<0.05

表2 产ESBLs与不产ESBLs大肠埃希菌AGs耐药情况比较 [例(%)]

3.产ESBLs菌株大肠埃希菌 AMEs基因携带情况 43株产ESBLs菌株中 AMEs基因携带率为88.37%(38/43),以 acc(3)-Ⅱ(79.07%)和 aac(6’)-Ⅰ(39.5%)为主,未检出 aac(6’)-Ⅱ基因。产ESBLs菌株的 acc(3)-Ⅱ和 aac(6’)- Ⅰ基因阳性率明显高于不产ESBLs菌株( P<0.05)。见 表3。

表3

表3

表3 产ESBLs与非产ESBLs大肠埃希菌AMEs基因携带率比较[例(%)] 修饰酶基因 株数 acc(3)-Ⅰ acc(3)-Ⅱ aac(6’)-Ⅰ aac(6’)-Ⅱ ant(2")-Ⅰ ant(3")-Ⅰ 产ESBLs 43 2(4.65) 34(79.07) 17(39.50) 0(0) 6(13.95) 3 (6.98) 不产ESBLs 39 3(7.69) 15(38.50)* 6(15.38)* 0(0) 7(17.25) 4 (10.25) 注:与产ESBLs菌株比较,* P<0.05

表3 产ESBLs与非产ESBLs大肠埃希菌AMEs基因携带率比较[例(%)]

ESBLs是一种丝氨酸酶衍生物,主要由肠杆菌科细菌产生,以肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌为代表。ESBLs基因由质粒介导,可通过结合、转化和转导等形式进行耐药性的传播和扩散。因此,产ESBLs大肠埃希菌引起的耐药问题给临床治疗带来极大困难。本研究发现ICU大肠埃希菌ESBLs检出率为52.4%,略高于文献^{[ 4]}报道。表明产ESBLs大肠埃希菌在本地区ICU流行严重,应引起足够的重视。

AGs因其抗菌谱广、疗效卓越在治疗革兰氏阴性杆菌感染中得到广泛的应用。近年来,由于抗生素泛用和过度治疗,其耐药性日趋严重。特别是产ESBLs大肠埃希菌对β-内酰胺酶类严重耐药的同时,对AGs耐药性也明显升高。本研究表明,本地区约90%的产ESBLs大肠埃希菌对AGs耐药,其中庆大霉素和链霉素的耐药率约70%左右,而阿米卡星和奈替米星的耐药率仅为10.7%左右。这可能与AGs的使用频率、种类和ESBLs的基因型相关^{[ 5]}。另外,与不产ESBLs大肠埃希菌相比,产ESBLs株庆大霉素、链霉素、卡那霉素和妥布霉素耐药率明显增加( P>0.05)。上述结果提示,本地区ICU医生不能经验性的把AGs作为产ESBLs大肠埃希菌感染的治疗药物,必须严格按照体外药敏结果来选用药物。

大肠埃希菌对AGs耐药的分子机制主要包括^{[ 6]}:(1)药物作用靶位的改变;(2)细菌细胞膜通透性改变,使进入胞内的抗菌药物减少;(3)产生AMEs;(4)细菌产生16SrRNA甲基化酶;(5)细菌通过主动外排机制将已进入胞内的药物泵至胞外。其中产生AMEs为主要原因。AMEs共价修饰抗菌药物的氨基或羧基导致其结构变化,从而丧失与靶点结合的能力。AMEs主要有N-乙酰转移酶(N-acetyltransferases,AAC)、O-核苷转移酶(O-nucleotidyltransferase,ANT)和O-磷酸转移酶(O-phosphotransferases,APH)。目前研究较多的主要是AAC和ANT。本研究通过PCR检测发现,产ESBLs菌株 AMEs基因携带率高达88.37%。6种AMEs基因中居前2位的是 acc(3)-Ⅱ(79.07%)和 aac(6’)-Ⅰ(39.5%)。本研究结果与黄永茂等^{[ 5]}报道类似,但罗建华^{[ 7]}等报道产ESBLs菌株 aac(3)-Ⅱ基因阳性率高达94.1%。原因可能是耐药细菌质粒介导的产ESBLs菌株具有区域特征性,不同区域有着不同的耐药基因特征。另外,本研究还发现产ESBLs菌株 acc(3)-Ⅱ和 aac(6’)-Ⅰ基因阳性率明显高于不产ESBLs菌株。这与产ESBLs菌株AGs耐药率高于不产ESBLs菌株相一致。肠杆科细菌酶基因常位于携带 ESBLs基因的质粒或转座子上^{[ 8]}。ESBLs 以 SHV和 CTX-M 为主要基因型。Karisik等^{[ 9]}发现携带 CTX-M-15基因型的大肠埃希菌的质粒上同时携带 acc(3)-Ⅱ和 aac(6’)-Ⅰ。因此,本研究推测造成产与不产ESBLs菌株 AMEs基因携带率差异的原因可能为产 ESBLs基因的质粒或转座子同时携带一个或多个 AMEs基因,质粒的转移和转座子的转座作用都有利于耐药基因由耐药菌向敏感菌传播,导致多重耐药。

总之,本地区产ESBLs大肠埃希菌对AGs耐药性日趋严重,其机制可能为携带产 ESBLs基因的质粒同时携带 AMEs基因。因此,深入了解质粒介导的耐药机制对研制新的有效的抗菌药物非常必要。