近年来,血栓性疾病发病率不断上升,严重威胁人类健康和生命,血小板(PLT)活化是血栓形成的始动因素,在血栓形成中起到关键作用。研究发现抗β₂糖蛋白I(β₂GPⅠ)抗体出现在多种血栓性疾病中,常见于抗磷脂综合征,能使体内PLT活化并和纤维蛋白结合,引起PLT聚集,与血栓形成关系非常密切。抗β₂GPⅠ抗体如何诱导血栓形成还不明确,其中PLT的活化聚集是整体上的病理机制,研究抗原抗体复合物对PLT活化的过程,对血栓形成机制和血栓性疾病预防和治疗具有重要意义。

抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)是自身抗体介导的、以血栓形成倾向为特征的获得性非炎症性自身免疫病,包括反复的动静脉血栓形成、习惯性流产并伴随抗磷脂抗体产生。该病目前的实验室诊断是患者血浆中查到抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody,aPL),包括抗β₂GPⅠ抗体、抗心磷脂抗体、狼疮抗凝物。但aPL并不直接与阴性磷脂结合,主要黏附磷脂的蛋白是β₂GPⅠ和凝血酶原^{[ 1]}。现在已知引起抗磷脂抗体最重要的血浆蛋白是β₂GPⅠ。抗β₂GPⅠ抗体在临床和流行病学研究上与APS的病理生理有关,这证实抗β₂GPⅠ抗体是影响血栓性疾病发病率和死亡率的一个显著的危险因子^{[ 2]}。

1.β₂GPⅠ结构和生理作用 β₂GPⅠ又叫载脂蛋白H,是单链糖蛋白,1961年由Schultze等学者首次报道,相对分子质量大约为50 000,含有326个氨基酸,在血浆中浓度大约在200 μg/mL,主要由肝脏分泌。β₂GPⅠ包括5个结构域,从氨基端到羧基端依次命名为I~V区。I~IV区结构相近,每个含有60个氨基酸和4个半胱氨酸,V区含82个氨基酸和3个二硫键,在V区的Cys281-Cys288区域有带正电荷且高度保守的序列,该序列位点和阴性磷脂结合起关键作用,V区的弯曲疏水环(Ser311-Lys317)对于插入磷脂双分子层有重要作用^{[ 3]}。有报道称血浆中β₂GPⅠ存在2种不同的构象,环型(闭合型)和开放型。环型时I区的位点是隐藏的,不能和抗β₂GPⅠ抗体结合。开放型的β₂GPⅠ是有活性的。在正常血浆中,环型和开放型所占的比例分别是91%、9%,环型为血浆中的主要形式^{[ 4]}。

完整的β₂GPⅠ 有氧化型和还原型2种形式,氧化还原的转化可能调节自身的生物活性。正常人血浆中还原型β₂GPⅠ大约占80%^{[ 5]},在用高氯酸提纯时会导致氧化。目前多种病理状态可以增加氧化型β₂GPⅠ在循环中的含量,氧化型增加了其免疫原性^{[ 6]}。还原型β₂GPⅠ的半胱氨酸可以被氧化和硝基化。还原状态的维持靠PLT和内皮细胞分泌的氧化还原酶类巯基的功能,主要是五区Cys288-Cys326的二硫键被氧化还原酶类还原^{[ 6]}。PLT和内皮细胞表面提供还原活性来维持β₂GPⅠ的还原状态,还原型β₂GPⅠ也可以保护内皮细胞避免过氧化氢的氧化性应激诱导^{[ 7]}。临床研究显示有血栓史的APS患者循环中氧化型β₂GPⅠ含量上升,细胞的活化维持了这种氧化环境。

以上的研究使我们推测还原型的β₂GPⅠ可能是环形结构,是存在于人体正常的血浆蛋白。目前的研究也认为在不存在抗β₂GP I抗体的情况下,β₂GP I不致病。还原型被氧化或硝基化后可能变为开放型而可以与抗体结合,引发一系列病理反应。

2. 抗β₂GPⅠ抗体和β₂GPⅠ的识别 关于抗β₂GPⅠ抗体如何识别并结合β₂GPⅠ主要有2种理论。第一种是“二聚化理论”,一个抗体必须结合2分子β₂GPⅠ才使其获得足够的亲和力。为了达到二聚化,必须有高密度的β₂GPⅠ吸附于PLT上。据报道,包被于PLT膜上的β₂GPⅠ量必须超过一定的阈值才能与抗β₂GPⅠ抗体结合。这一理论以前被多数人接受,但是一些疑问仍然不能解释。另一种假说是基于aPL对隐蔽位点的识别,只有当β₂GPⅠ和阴性电荷表面结合后才暴露出与抗体的结合位点^{[ 8]}。研究认为,单体β₂GPⅠ对PLT膜只有低亲和力,当其第V区和膜结合后,构象发生改变,诱导β₂GPⅠ的I区变化,暴露出隐蔽位点,抗β₂GPⅠ抗体与隐蔽位点结合,形成稳定的二聚体结构^{[ 3]}。Laat等^{[ 9]}的研究支持上述观点,进一步指出I区有糖链覆盖,构象变化后暴露多个隐蔽位点,抗β₂GPⅠ抗体与β₂GPⅠ单体上G40-R43位点结合。抗体使抗原二聚化极大的增加了对负性磷脂和多种细胞受体的亲和力,使细胞间能够相互作用^{[ 3]}。

循环中的β₂GPⅠ有免疫惰性。当β₂GPⅠ被阴性磷脂捕获后,开放结构是稳定的,固定后的结构暴露出与自身抗体结合的表位^{[ 6]}。临床研究证实感染可能是触发APS的原因之一,革兰阴性菌的脂多糖(LPS)启动了病理反应。研究认为β₂GPⅠ的V区羧基端和LPS的非脂质A部分结合而引起构象变化,开放的β₂GPⅠ暴露出隐蔽位点,可能导致APS易感患者产生免疫应答,从而产生抗β₂GPⅠ抗体。开放的β₂GPⅠ的V区能和PLT、内皮细胞等的阴性磷脂膜结合,暴露的I区能和抗β₂GPⅠ抗体结合,最终导致了血栓栓塞后遗症^{[ 10]}。

1. 载脂蛋白E受体2'与GPⅠbα活化PLT 载脂蛋白E受体2'(apoER2')又叫低密度脂蛋白受体相关蛋白,属于低密度脂蛋白受体家族。apoER2'膜外功能区包括3个部位,A区是受体配体相互作用的低密度脂蛋白(LDL)结合区,带负电荷,B区类似表皮生长因子前体,C区是蛋白O-联的糖区,是细胞表面的LDL分离区^{[ 11]}。

在体外构建二聚化β₂GPⅠ模拟抗体使β₂GPⅠ二聚化,研究证实PLT膜上apoER2'和GPⅠbα2个受体是二聚化β₂GPⅠ在PLT的结合位点。二聚化β₂GPⅠ使黏附于胶原表面的PLT增加,并且不断聚集,加快血栓形成^{[ 1]}。Lummel等^{[ 3]}分别构建了不同结构域缺陷的二聚化β₂GPⅠ,实验证实二聚化β₂GPⅠ的V区和PLT膜上apoER2'作用然后活化PLT,并且作用部位和V区疏水环没有重叠。在小鼠的APS模型中证实鼠源性抗β₂GPⅠ单抗加速了β₂GPⅠ的二聚化,使血栓形成增加。apoER2'缺陷型小鼠的病理进展出现明显的下降,用野生型鼠的可溶性apoER2'的A区可以抑制抗体对抗原的二聚化作用。实验说明apoER2'参与了抗磷脂抗体对疾病的病理过程^{[ 12]}。

研究证实二聚化β₂GPⅠ与GPⅠbα的相互作用是Zn²⁺依赖型而不是Ca²⁺依赖型。β₂GPⅠ的V区包含大量阳性电荷,推测可能和GPⅠbα的带阴性电荷的硫化酪氨酸区域结合。GPⅠbα的硫化酪氨酸区域是和凝血酶结合的主要位点,也是和二聚化β₂GPⅠ相互作用的重要区域,高度硫化的GPⅠbα和二聚化β₂GPⅠ的结合能力强^{[ 3]}。GPⅠbα被认为是PLT最重要的黏附受体,GPⅠbα表面还能黏附vWF。近年来,GPⅠbα的另一些功能也被发现,其可作为凝血酶激活蛋白酶活化受体1(PAR1)的共同受体,配体黏附GPⅠbα可以导致细胞间信号传导,说明GPⅠbα活跃的参与了PLT的整个激活过程^{[ 13]}。

在二聚化β₂GPⅠ的作用下PLT对纤维蛋白黏附力的增强受到apoER2' 和GPⅠbα的共同介导。研究证实用二聚化β₂GPⅠ刺激PLT后,PLT的黏附力上升到150%(与对照组比较),用可溶性GPⅠbα竞争性阻断二聚化β₂GPⅠ和GPⅠbα的结合位点后,完全消除了二聚化β₂GPⅠ介导的PLT黏附力增强。同样的可溶性apoER2'也可以完全竞争性抑制二聚化β₂GPⅠ引起的的黏附力增强。受体相关蛋白(RAP)是配体和膜上LDL受体家族结合的抑制剂,加入RAP可阻断apoER2'与二聚化β₂GPⅠ的结合位点。实验还证明在没有二聚化β₂GPⅠ加入时,单纯加入可溶性apoER2'、GPⅠbα 或RAP后PLT与纤维蛋白的黏附力没有变化^{[ 13]}。二聚化β₂GPⅠ的受体在PLT黏附和聚集中起到了交联固定的作用,GPⅠbα和apoER2'都参与了这个过程,封闭其中任意一个受体都完全阻止了PLT的黏附和聚集^{[ 1]}。

研究证明GPⅠbα的转移和apoER2'的解离是2个独立过程。阻断apoER2'对细胞骨架上的GPⅠbα没有影响,同样阻断GPⅠbα对apoER2'的解离也无作用。在流动的血液中阻断任意1条信号传导途径都足以消除二聚化β₂GPⅠ对PLT活化的影响。用二聚化β₂GPⅠ刺激PLT,引起apoER2'从细胞支架片断上的衔接蛋白Dab1分离并和二聚化β₂GPⅠ结合,刺激使GPⅠbα通过14-3-3ζ转移到细胞骨架上,作为二次刺激导致连续的活化,活化的p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化导致血栓烷A₂(TXA₂)合成。TXA₂是由PLT产生的引起PLT聚集和血管收缩的主要物质,能进一步介导PLT活化^{[ 13]}。

二聚化β₂GPⅠ对apoER2'的亲和力要高于单体 GPⅠbα,而GPⅠbα在PLT膜上的数量要远远多于apoER2',因此可能GPⅠbα是二聚化β₂GPⅠ的一个停泊位点,使之初步黏附之后,然后通过apoER2'固定,产生一系列信号传导^{[ 14]}。最近也有报道说GPⅠbα和apoER2'可能是受体复合物^{[ 15]},参与了APS的发病机制。也有人认为GPⅠbα可能和不同的PLT受体形成了不同的复合物。二聚化β₂GPⅠ而不是单体β₂GPⅠ除了可以和apoER2'、GPⅠbα结合,还可以和LRP、LDL-R、VLDL-R、Megalin结合,这样可以活化大量不同的细胞,产生特异的不同应答类型^{[ 16]}。

2. 抗β₂GPⅠ抗体/β₂GPⅠ通过PLT因子4活化PLT 血小板因子4(PF4)是CXC趋化因子家族成员,由活化的PLT分泌,能结合于PLT表面。PF4对肝素和PLT表面的葡聚糖有亲和力。PF4和β₂GPⅠ的相互作用可以直接用黏附测定法证实。在固相和液相状态PF4和β₂GPⅠ都能结合^{[ 17]}。细胞图像分析技术证实PF4是以四聚体形式和β₂GPⅠ结合 。抗β₂GPⅠ抗体识别(β₂GPⅠ)₂-(PF4)₄复合体,并且强制他们形成这样的结构,然后与之形成复合物。这种复合物可活化PLT。把抗β₂GPⅠ抗体加入(β₂GPⅠ)₂-(PF4)₄孵育后生成TXB₂的量和p38MAPK磷酸化水平都达到最大值^{[ 17]}。抗β₂GPⅠ抗体诱导血栓形成可能是通过PF4/β₂GPⅠ复合物引起PLT活化聚集,该复合物可能活化淋巴结处的B细胞和T细胞引起免疫反应,使抗β₂GPⅠ抗体不断产生。

3.β₂GPⅠ对vWF的作用 Hulstein等^{[ 18]}发现β₂GPⅠ抑制了vWF诱导的PLT聚集,加入β₂GPⅠ后PLT对vWF的黏附减少了50%。β₂GPⅠ结合于vWF的A1区,活化的GPⅠbα也与vWF的A1区位点结合。β₂GPⅠ与vWF的复合物不能使PLT聚集,说明β₂GPⅠ阻断了vWF与GPⅠbα的结合,从而抑制血栓形成。抗β₂GPⅠ抗体与vWF竞争性的结合β₂GPⅠ,使β₂GPⅠ失去了作为vWF抑制剂的作用。但也有研究认为氧化型β₂GPⅠ抑制PLT对vWF的黏附,体外被硫氧还蛋白-1还原的还原型β₂GPⅠ增强了PLT上GPⅠbα对vWF的黏附力,使PLT黏附于活化的vWF增加^{[ 19]}。

p38MAPK是细胞内重要的信号级联组成部分,启动多种细胞的炎性反应,还有调节细胞因子的释放和中性粒细胞对炎症刺激应答的重要功能。许多不同的刺激物可以活化p38MAPK。

实验证明小鼠体内aPL诱导的PLT聚集、血栓形成和内皮细胞活化都被p38MAPK抑制剂SB203580完全阻断。小鼠提早用SB203580预处理,后来再用aPL诱导,则小鼠不会出现PLT聚集,血栓也有显著减低。这说明p38MAPK参与了体内血栓形成过程^{[ 20]}。

目前研究认为p38MAPK活化通路机制是抗β₂GPⅠ抗体和β₂GPⅠ结合后活化PLT膜上apoER2'和GPⅠbα,引起p38MAPK磷酸化后信号级联扩大,然后传到细胞溶质磷脂酶A2(cPLA2),产生花生四烯酸,最终使TXB2(TXA2的稳定形式)大量释放,PLT不断活化和凝集。p38MAPK活化通路不仅是抗β₂GPⅠ抗体介导的PLT细胞内活化通路,而且也是内皮细胞和单核细胞活化的关键途径,用p38MAPK抑制剂SB203580也可以抑制这些通路^{[ 21]}。

抗β₂GPⅠ抗体对PLT的活化是一个复杂的激活过程。最主要是直接通过PLT表面受体激活途径,也可通过活化内皮细胞、单核细胞等方式间接活化PLT,最终多个途径不断级联放大进一步激活PLT,使其不断黏附聚集,最后形成血栓。可以通过加入无害化竞争性抑制剂阻断体内病原性抗体与抗原的结合,或阻断受体信号传导来防止PLT连续活化,达到抑制PLT活化和血栓形成,这在理论上为治疗血栓性疾病开拓了一些新思路。近年来,随着对PLT活化途径和机制的不断研究,新的治疗策略不断被提出,在不久的将来可能会有更加安全和有效的治疗方式。