引用本文
侯利丹, 刘鹥雯, 何怡青, 杨翠霞, 杜艳, 高锋. 正常与乳腺肿瘤细胞表面黏附分子CD44活化状态差异分析. 检验医学, 2013, 28(5): 425-429
HOU Lidan, LIU Yiwen, HE Yiqing, YANG Cuixia, DU Yan, GAO Feng. Analysis on the differences of surface adhesion molecule CD44 activation states in normal cells and breast tumor cells. Labratory Medicine, 2013, 28(5): 425-429  
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正常与乳腺肿瘤细胞表面黏附分子CD44活化状态差异分析
侯利丹, 刘鹥雯, 何怡青, 杨翠霞, 杜艳, 高锋
上海交通大学附属第六人民医院中心实验室,上海 200233
通讯作者:高锋,联系电话:021-64369181。

作者简介:侯利丹,女,1988年生,硕士,主要从事肿瘤靶向治疗研究。

基金:国家自然科学基金(No.81071814、81172027、81272479); 上海市科委重点项目 (No.10411950500); 上海市优秀学术带头人计划 (No.11XD1404000)
摘要
目的 检测黏附分子CD44在正常和乳腺肿瘤细胞表面的表达,并分析其活化状态差异,为以CD44为靶点的肿瘤靶向治疗提供新的理论依据。方法 采用流式细胞术检测20名正常人外周血单个核细胞(PBMCs)、正常小鼠胚细胞NIH3T3及人乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549表面CD44表达水平;使用荧光标记透明质酸(FL-HA),通过流式细胞术分析CD44的活化状态;再运用细胞免疫荧光的方法观察HA与不同活化状态CD44的靶向结合情况。结果 正常人PBMCs、NIH3T3与乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549表面均高表达CD44,阳性表达率>95%。PBMCs、NIH3T3的CD44与FL-HA结合活性相对较低,分别为(3.61±2.65)% 和(14.33±1.35)%,而乳腺肿瘤细胞表面CD44与FL-HA结合活性高(>90%)。细胞免疫荧光显示NIH3T3细胞表面基本无荧光,HA不靶向结合CD44,而Hs578T和BT-549细胞表面呈现强荧光,HA靶向结合CD44。结论 正常细胞PBMCs、NIH3T3表面虽然高表达CD44,但与其天然配体HA结合活性较低,而乳腺肿瘤细胞表面高表达CD44且与其配体HA结合活性很高。提示CD44分子在正常和肿瘤细胞表面存在相对静止与活化2种状态,前者与HA结合活性较低,后者与HA结合活性高。提示以HA为靶向分子、CD44为靶点的抗肿瘤药物,能够选择性杀伤高表达CD44的肿瘤细胞而不影响正常细胞。
关键词: CD44; 活化状态; 乳腺肿瘤; 外周血单个核细胞
中图分类号:R446.6 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)05-0425-05
Analysis on the differences of surface adhesion molecule CD44 activation states in normal cells and breast tumor cells
HOU Lidan, LIU Yiwen, HE Yiqing, YANG Cuixia, DU Yan, GAO Feng
Department of Central Laboratory,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200233,China
Abstract
Objective To detect the expressions of surface adhesion molecule CD44 in normal cells and breast tumor cells, and analyze the differences of CD44 activation states in order to provide a new theoretical reference for CD44 targeted cancer therapy. Methods The expressions of CD44 in normal peripheral blood mononuclear cells(PBMCs),normal mouse fibroblast NIH3T3 cells and human breast tumor cell Hs578T and BT-549 were determined by flow cytometry. The activation states of CD44 were analyzed by flow cytometry, using fluorescence-labeled hyaluronic acid(FL-HA), and then the targeted binding ability of HA-CD44 was observed by cell immunofluorescence. Results CD44 was abundantly expressed in normal PBMCs, NIH3T3 and breast tumor cell Hs578T and BT-549 (the positive expression rate was >95%). The binding ability of the breast tumor cell surface CD44 with FL-HA (>90%) was much stronger than those of PBMCs [(3.61±2.65)%] and NIH3T3[(14.33±1.35)%]. NIH3T3 cell showed almost no fluorescence(HA targeted binding without CD44), while Hs578T and BT-549 showed strong fluorescence (HA targeted binding with CD44)according to cell immunofluorescence. Conclusions Normal cell PBMCs and NIH3T3 have high expressions of CD44 and low binding ability with HA, while breast tumor cell Hs578T and BT-549 have high expressions of CD44 and high binding ability with other HA. CD44 in normal cells and breast tumor cells shows 2 different activation states:inactive and active. The anti-tumor drugs with HA as targeted mononuclear and CD44 as target can select high-expression CD44 killer tumor cells and have no influence on normal cells.
Keyword: CD44; Activation state; Breast tumor; Peripheral blood mononuclear cell
引言

CD44是一种广泛分布于细胞表面的跨膜糖蛋白受体[ 1, 2]。其配体透明质酸(HA)是一种由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸为结构单元的高分子黏多糖,是细胞外基质的主要组成部分。据报道,CD44与HA结合,可介导细胞与细胞外基质黏附、淋巴细胞归巢等多种生理和病理过程[ 3, 4]。许多肿瘤细胞表面CD44高度表达,其在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用。目前,已有许多学者以CD44为靶点分子,通过阻断CD44-HA结合从而降低肿瘤转移,进行肿瘤的靶向治疗。Zawadzki等[ 5]运用CD44s受体蛋白、CD44v10受体蛋白和CD44单克隆抗体阻断小鼠B16F10黑色素瘤CD44与其配体HA结合,发现在不进行任何其他处理的情况下,CD44s受体蛋白和CD44v10受体蛋白可使肿瘤在肺部的转移量分别降低70%和60%,CD44单克隆抗体也取得了基本相同的效果。近年来,随着纳米载药系统研究的兴起,纳米颗粒连接靶向分子HA,针对肿瘤细胞表面CD44进行肿瘤靶向治疗取得很大进展。Auzenne等[ 6]发现HA-PTX纳米颗粒对CD44阳性人卵巢癌细胞SKOV-3ip 和NMP-1的杀伤活性明显大于单纯PTX,加入过量游离的HA能够阻断这种增强的杀伤活性,提示HA-PTX通过靶向细胞表面CD44,达到增强杀伤细胞的效果。

虽然许多学者成功以CD44为靶点,HA为靶向分子,靶向杀伤肿瘤,提高药物疗效[ 7, 8]。但是,关于以CD44为靶点靶向杀伤肿瘤细胞的同时,是否会靶向杀伤高表达CD44的正常细胞这一问题,少有报道。研究显示CD44与HA的结合并不完全是自发的,不同活化状态的CD44与HA的结合活性不同,与CD44糖基化[ 9]、细胞类型[ 10]和HA自身状态[ 11] 等因素相关。许多肿瘤细胞如乳腺癌细胞、肺癌细胞表面CD44处于活化状态,不需要任何刺激因素即能自发结合HA[ 12]。正常细胞表面CD44处于何种状态,是否存在上述调控,目前仍未阐明。我们通过检测CD44与其天然配体HA的结合活性,探讨正常细胞和乳腺肿瘤细胞表面CD44的活化状态是否存在差异,旨在深入分析以HA为靶向分子,CD44为靶点进行肿瘤靶向治疗的可行性,明确HA是否选择性靶向肿瘤细胞表面CD44,而不靶向同样高表达CD44的正常细胞。

材料和方法
一、细胞

乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549,正常小鼠胚细胞NIH3T3均购自中国科学院典型培养物保藏中心;分离20名正常人肝素钠抗凝血获取其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。

二、主要试剂

RPMI1640培养液、DMEM培养液均购自GIBCO公司,淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司,PE标记的鼠抗人CD44单克隆抗体, PE标记的鼠抗人CD44同型对照抗体均购自eBioscience公司, PE/Cy5标记的鼠CD44单克隆抗体购自Abcam 公司,荧光标记的透明质酸(FL-HA)购自Calbiochem公司。

三、细胞培养

将Hs578T细胞在DMEM培养液(含10%胎牛血清、0.01 mg/mL牛胰岛素)中常规培养;BT-549细胞在RPMI1640培养液(含10%胎牛血清、0.023 U/mL牛胰岛素)中常规培养;NIH3T3细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养。培养条件均为5%CO2、37 ℃,饱和湿度。所有实验细胞均取自对数生长期。

四、Ficoll法分离人外周血单个核细胞

取正常人肝素钠抗凝血4 mL,加入等体积磷酸盐缓冲液(PBS)充分混匀,将其缓慢加入适量淋巴细胞分离液中,800× g水平离心15 min,小心吸取白膜层,用PBS 400× g离心10 min洗涤2遍,即获取人外周PBMCs。

五、流式细胞术鉴定细胞表面CD44的表达

分别取肝素钠抗凝血100 μL,加入2个流式专用管中,实验组加入适量CD44-PE单克隆抗体,阴性对照加入等体积CD44-PE同型对照抗体,轻轻混匀,室温避光孵育15~30 min后,在QPREP免疫学样品制备仪(COULTER公司生产)上处理血标本,流式细胞仪分析结果。0.25%胰酶分别消化处于对数生长期的NIH3T3细胞、Hs578T细胞和BT-549细胞,显微镜下观察。细胞呈单细胞悬液时用含血清的培养液终止消化,200× g离心5min,弃上清,再用适量PBS洗涤2遍计数,所有细胞均按每管约106个细胞的比例,收集至2个Eppendorf管中。NIH3T3细胞实验组加入适量鼠CD44单克隆抗体,乳腺肿瘤细胞实验组加入适量鼠抗人CD44单克隆抗体,对照组加入等体积CD44同型对照抗体,室温避光放置15~30 min,PBS洗涤2遍,500 μL PBS重悬,移至流式管中上机检测,收集10 000个细胞,荧光强度以对数放大,结果用CD44细胞的阳性率表示,数据用软件进行分析。

六、流式细胞术检测细胞表面CD44的活化状态

用Ficoll法分离获取2管人外周PBMCs,每管细胞数量约在106左右。0.25%胰酶分别消化处于对数生长期的小鼠胚细胞NIH3T3和乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549,显微镜下观察。细胞呈单细胞悬液时用含血清的培养液终止消化,200× g,离心5 min,弃上清,再用适量PBS洗涤2遍,PBS重悬后计数,所有细胞均按比例收集于2个Eppendorf管中,每管约106个细胞。每种细胞均分为实验管和对照管,实验管加入40 μg/mL FL-HA 100 μL重悬,对照管加入100 μL培养液,37 ℃避光孵育2 h。然后用PBS洗涤2遍,移至流式管中,上机检测。

七、细胞免疫荧光法观察FL-HA与细胞表面CD44的靶向结合作用

分别收集对数生长期的小鼠胚细胞NIH3T3和人乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549,消化至单细胞呈单个悬液,接种到24孔培养板中,培养24~48 h,随机分为实验组和对照组,每组设双复孔,实验组加入40 μg/mL FL-HA 200 μL,对照组加入200 μL 培养液,37 ℃避光孵育1 h,PBS洗涤2遍,荧光显微镜下观察。

八、统计学方法

采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析,结果用 ±s表示,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行各组间均数比较。 P<0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、正常细胞与肿瘤细胞表面CD44的表达

正常人PBMCs、NIH3T3细胞及Hs578T细胞、BT-549细胞均高表达CD44,见 图1。CD44细胞的阳性率分别为(99.57±0.31)%、(99.26±0.81)%、(99.85±0.21)% 和(99.99±0.10)%,各组间CD44表达差异无统计学意义( P>0.05)。

图1 流式细胞术检测细胞表面CD44的表达 注:A为Hs578T 细胞;B为BT-549细胞;C为NIH3T3细胞;D为正常人PBMCs

二、正常细胞与肿瘤细胞表面CD44的活化状态

正常人PBMCs、NIH3T3细胞表面CD44与HA结合活性较低;乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549表面CD44与HA结合活性较高,CD44处于活化状态,见 图2。CD44活化阳性率分别为(3.61±2.65)%、(14.33±1.35)%、(93.4±6.40)% 和(94.70±0.15)%,PBMCs、NIH3T3细胞与乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549表面CD44活化差异有统计学意义( P<0.05),提示上述正常细胞表面CD44处于相对静止状态,乳腺肿瘤细胞表面CD44处于活化状态。

图2 流式细胞术检测细胞表面CD44的活化 注:Hs578T(A)和BT-549 (B) 细胞实验组荧光强度较对照组明显增强;NIH3T3细胞(C) 和正常人PBMCs(D)之间无明显变化

三、FL-HA与细胞表面CD44的靶向结合

在荧光显微镜下观察可见,与FL-HA孵育后,NIH3T3细胞与对照组荧光强度无明显差异,表明FL-HA基本不与细胞表面CD44结合,无靶向作用,CD44处于相对静止状态;而乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549与对照组相比,细胞表面发呈现出强绿色荧光,提示FL-HA与肿瘤细胞表面CD44高度靶向结合,CD44处于活化状态,见 图3。

图3 细胞免疫荧光观察FL-HA与细胞表面CD44结合活性 注:Hs578T和BT-549细胞呈现强绿色荧光,NIH3T3细胞基本无绿色荧光

讨论

近年研究发现,黏附分子CD44在许多恶性肿瘤细胞表面高度表达,如乳腺癌、结肠癌等。其与肿瘤的侵袭和转移密切相关,特别是与天然配体HA的结合在肿瘤恶性进展中的作用受到广泛关注[ 13]。目前已有学者运用HA、CD44单克隆抗体、CD44受体蛋白等阻断CD44与HA的结合,有效减小肿瘤体积,抑制肿瘤转移;以HA为靶向分子制作的药物通过结合靶点CD44有效地提高了药物在肿瘤部位的聚集,增加药物的生物利用度,达到靶向治疗肿瘤的效果。尽管许多学者已将肿瘤细胞表面高表达的CD44作为靶点进行肿瘤靶向治疗研究,但在HA-化疗药靶向结合肿瘤细胞表面CD44,提高药物对肿瘤细胞的杀伤效果的同时,机体许多正常细胞同样高表达CD44,是否能够免受靶向药物的杀伤,及其如何免受其杀伤的机制,目前少有研究。

本研究分析了正常人PBMCs、NIH3T3细胞和乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549表面的CD44表达及其活化状态——即其与HA的结合活性。首先采用流式细胞术检测上述正常和肿瘤细胞表面CD44的表达水平,结果显示正常人PBMCs、NIH3T3细胞和乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549均高表达CD44,阳性率在95%以上,验证了在正常细胞和肿瘤细胞表面CD44均存在高表达的现象。在此基础上,应用FL-HA通过流式细胞术检测CD44与HA的结合活性。结果显示正常人PBMCs、NIH3T3细胞表面CD44与HA结合的活性较低,分别为(3.61±2.65)%和(14.33±1.35)%;乳腺肿瘤细胞表面CD44与HA的结合活性远远高于正常人PBMCs和NIH3T3细胞,均高于90%。正常与肿瘤细胞表面CD44与HA的结合活性存在相对差异。

本研究进一步阐明了正常细胞和肿瘤细胞表面CD44的活化状态差异影响HA与其靶向结合的能力。NIH3T3细胞中加入FL-HA孵育后,荧光显微镜下观察显示NIH3T3基本无荧光,提示CD44处于相对静止状态,FL-HA与其靶向结合很弱。而肿瘤细胞表面呈现强绿色荧光,提示乳腺肿瘤细胞表面CD44处于活化状态,FL-HA与其有很强的靶向结合活性。这一现象说明以HA为靶向分子,以CD44为靶点制备抗肿瘤药物,药物能够选择性靶向高表达CD44的肿瘤细胞,有效提高药物对肿瘤的杀伤作用,但同样高表达CD44的正常细胞,由于CD44处于相对静止状态,与HA结合活性较低,药物对其无靶向及杀伤作用。这一结果提示,HA在靶向杀伤高表达CD44的肿瘤细胞时,机体高表达CD44的正常组织可以免受其杀伤。

综上所述,本研究初步发现了CD44分布于正常和肿瘤细胞上的活化状态不同。以HA为靶向分子、CD44为靶点进行肿瘤靶向治疗时,能够特异杀伤肿瘤细胞,有效避免靶向杀伤高表达CD44的正常细胞,为以CD44为靶点进行的肿瘤靶向治疗研究提供了新的依据。但本研究对CD44活化状态的研究尚处于初级阶段,所用细胞局限为乳腺肿瘤细胞,其他肿瘤尚未涉及,有待进一步探索。另外,有关正常与肿瘤细胞表面不同活化状态CD44的产生机制及其生物学意义,仍需进一步深入研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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