MRD是指白血病患者经诱导缓解治疗达到临床缓解后,其体内残存的用形态学方法无法检出的微量白血病细胞,这些残存的白血病细胞是患者复发的根源。

近20年的临床实践表明,MRD检测结果和复发风险高度相关,也证实了至少在治疗的早期阶段,残留的白血病细胞在骨髓中的分布是高度一致的^{[ 2]}。这些先期研究为MRD检测的合理性、有效性和可靠性提供了理论依据。也回答了一些研究者认为在治疗期间患者体内白血病细胞并非均匀地分布于骨髓中,从而对MRD检测准确性的质疑。

纵观MRD检测方法探索的历史,形态学方法、染色体核型分析技术、荧光原位杂交技术以及DNA含量检测异倍体细胞技术等,都因敏感性低或有效覆盖范围小的局限而不适于MRD检测。临床对MRD检测的方法要求是：敏感性至少达到≤0．1％,最好是≤0．01％;其应用能够有效覆盖绝大多数患者;检测结果具有高重复性;便于实现检测方法的标准化以及开展室间质量评价。按此标准,目前适合MRD检测的方法只有聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）和流式细胞术（flow cytometry, FCM）^{[ 6, 7]}。

（一）PCR

1． 克隆性的抗原受体基因重排 由于ALL细胞是从单个早期病变淋巴细胞发展而来,故大多数病例的ALL细胞具有克隆性的免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）基因和／或T细胞受体（T-cell receptor, TCR）基因重排。重排的V-（D）-J结合部序列具有白血病克隆特异性,不同的正常淋巴细胞的结合部序列不同,而非淋巴细胞无抗原受体基因重排,据此将三者区分出来^{[ 4]}。用基因重排标志检测MRD时,必须在初诊时对每个患者克隆特异性V-（D）-J重排的结合部序列测序,根据此序列设计结合部特异性寡核苷酸探针或是引物用于PCR扩增^{[ 8]},通常使用实时定量PCR（real-time quantitative PCR, RQ-PCR）方法^{[ 9]}检测,已较少使用有限稀释方法。绝大多数B-ALL和T-ALL患者分别具有Ig基因重排和TCR基因重排,但由于ALL细胞保持有较强的重组活性,导致90％的B-ALL 有TCR基因跨系重排,20％的T-ALL有Ig基因的跨系重排^{[ 4]}。两者结合起来,利用基因重排标志可以对绝大多数儿童和成人ALL患者进行MRD检测工作,并可达到0．001％的敏感性^{[ 4, 6, 10, 11, 12]}。尽管Ig／TCR基因重排的PCR检测方法显示出如上优点,但不同实验室各自设计的许多不同引物系统的适用性和敏感性都有较大的差异。因此,包括欧洲7国（荷兰、比利时、西班牙、葡萄牙、英国、德国和法国）的47个研究机构于1998年共同参与并启动了BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936项目,命名为“用于淋巴增殖性疾病早期诊断的基于PCR技术的克隆性指标研究”,其目的是为克隆性诊断而发展建立标准化的PCR检测方案和PCR引物系统。在此项目参与者的努力下,此方法已获得全面优化和标准化,为在世界各国的实验室推广使用做出了贡献^{[ 4, 6]}。由于每个ALL细胞仅有一个拷贝的Ig／TCR基因重排,故Ig／TCR基因重排的检测方法可以精确地评估MRD水平。但是Ig和TCR基因可能会发生进一步的二次重排^{[ 13]},从而将导致Ig／TCR基因重排完全不同的亚克隆白血病细胞的产生,造成假阴性。因此,建议需对患者初发时即存在的2种或更多不同的重排标志同时进行监测^{[ 8]}。但据报道,仅有71％的病例在疾病初发时同时具有2种重排标志^{[ 10]}。而对于仅有1种基因重排方式的患者,可以通过联合应用FCM或融合基因PCR方法来减少出现假阴性结果的风险^{[ 2]}。克隆性抗原受体基因重排的检测很耗时,常因未能及时完成结合部测序,并根据测序结果再合成引物或寡核苷酸链,从而错过了较早的监测时间点（如第15天）^{[ 14]}。随着大规模平行测序技术的出现,在降低检测成本的同时,使得应用通用引物（用一对引物扩增所有可能的Ig／TCR基因重排部位）和平行测序技术在初诊时及时确定有意义的重排结合部序列成为可能^{[ 15]}。随访的样本用同样的方式扩增,寻找是否存在初诊时所确定的结合部序列即可,避免了针对每位患者合成引物或探针并设定PCR反应条件的不便。此方法的特异性和敏感性很高,如果有足够的DNA,敏感性可以达到0．000 1％^{[ 15]}。Faham等^{[ 16]}最早用这种方法研究了10名ALL患者初诊和随访时的样本,在FCM和传统PCR方法检测为阳性结果的5名患者中检出了所有阳性,MRD水平也高度一致;在FCM和传统PCR方法为阴性结果的5名患者中也发现了1名患者有0．000 1％水平的明确的白血病来源的序列,显示出了新方法具有更高的敏感性。因此,大规模平行测序技术极大地促进了ALL MRD的分子检测,并可能替代现有的分子检测方法。

2． 融合基因 融合基因（如 BCR-ABL1、 MLL-AFF1、 TCF3 -PBX1及 ETV6 -RUNX1等）及其mRNA转录本可作为ALL细胞区别于正常细胞的另一类分子标志^{[ 17]}。但仅有大约40％的ALL患者具有融合基因^{[ 4]},故应用比较局限。然而,随着全基因组扫描技术的广泛应用,将可能为MRD检测发现更多的遗传标志^{[ 18]}。新近发现的融合基因标志物为包含CRLF2的融合基因（如 IgH-CRLF2和 P2 RY8 -CRLF2）。大约15％缺少传统融合基因标志的成人ALL和高危儿童B-ALL病例以及大约一半患有与唐氏综合征相关的ALL患者具有此种融合基因标志^{[ 19, 20]}。以融合基因作为标志物的优点是初发时所检测到的融合基因在治疗过程中不会发生进一步的改变;而且使前白血病细胞的检测成为可能^{[ 21]}。其缺点是,由于PCR产物和白血病细胞数的比例无法确定,故难以对样本中残存的白血病细胞数做出精确的评估^{[ 17]}。该技术方法的理论敏感性可以达到0．001％,而事实上通常只有0．01％^{[ 2]}。

（二）FCM

用FCM检测ALL MRD的基本原理是利用白血病细胞的异常免疫表型特征使之与正常细胞予以区分^{[ 22]}。ALL白血病相关免疫表型（leukemia associated immunophenotype, LAIP）主要有3类。

第1类是由融合基因表达的融合蛋白,如 BCR-ABL1、 ETV6 -RUNX1和 TCF3 -PBX1,但目前尚缺乏相应的适合用于FCM检测的抗体。有研究表明,一些新发现并用于MRD检测的CD分子的异常表达和这些融合蛋白的表达显著相关^{[ 23]}。

第2类是幼稚T细胞免疫表型。由于T-ALL细胞的正常对应细胞——幼稚T淋巴细胞只存在于胸腺,且ALL中只有T-ALL的白血病细胞在骨髓和外周血中分布一致^{[ 24]}。故对于T-ALL MRD的检测不必依靠识别异常免疫表型特征,在骨髓或外周血中发现的幼稚T细胞免疫表型的细胞即可确认为T-ALL细胞。用于T-ALL MRD检测最常用的免疫表型为同时表达末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT）和CD3,或同时表达TdT和CD5^{[ 24]};此表型也可用于检测T细胞淋巴瘤是否侵犯骨髓和外周血^{[ 25]}。此外,其他只限于胸腺内T细胞表达的表型特征也已成功地应用于T-ALL MRD检测^{[ 26]}。

第3类是只见于B-ALL细胞,而不见于正常B淋巴细胞的抗原异常表达方式^{[ 27]}。B-ALL细胞的正常对应细胞——早期前体B淋巴细胞在健康成人、正接受皮质醇治疗或化疗的患者骨髓中数量很少;而在儿童骨髓甚至是外周血中或白血病患者骨髓移植后及化疗终止后的重建期的骨髓中数量较多^{[ 28]}。因此,应注意不要将在正常个体中难以检测到的正常细胞误认为白血病细胞。B-ALL MRD检测的方案远比T-ALL MRD检测复杂,检测方案主要依靠寻找并识别异于正常前体B淋巴细胞的LAIP。LAIP与正常B细胞抗原表达的差异主要表现在2个方面：量的差异和质的差异。

量的差异包括抗原的过强表达（如CD19、CD10、CD34、CD58和TdT）和抗原的弱表达（如CD38、CD45）。这些抗原在B-ALL细胞和正常细胞都有表达,但在表达强度上可有明显差异。白血病细胞膜表面的CD19、CD10和CD34等的表达量常比正常的B系干祖细胞高10倍^{[ 29]};另外,CD38和CD45的表达却常显著弱于正常细胞^{[ 30]}。

质的差异是指：（1）在正常早期B淋巴细胞中极少表达的其他系列的抗原,如CD13、CD33、CD15、CD65和CD56^{[ 31]};（2）表达时相混乱的抗原,如CD21／CD34和cμ／CD34;正常情况下,CD21、cμ与CD34是分属不同发育阶段出现的抗原,如CD21和CD34、cμ和CD34同时表达,则可确认为白血病细胞^{[ 31]};（3）与染色体异常有关的抗原,如KOR-SA3544（CD66c）,据报道此抗原与 BCR-ABL基因重排有关^{[ 32]}。

用于MRD检测的抗体组合通常还包括CD19、CD10和CD34抗体构成的“骨架”组合,“骨架”组合用于选取带有早期标志的B细胞作为分析对象^{[ 31]}。由于每个抗体组合并非能应用于所有的B-ALL患者,因此必须用上述这些经典LAIP对每一位患者初发或复发时的骨髓细胞进行MRD检测指标有效性的确认。有效性确认所用的对照样本除了采用正常骨髓外,还需采用非B-ALL白血病患者重建期的骨髓,以防生理状态下难以见到的正常早期B细胞被误认为白血病细胞。

然而仅依靠上述这些经典的LAIP,并不能覆盖所有的B-ALL患者。受先期研究中确认CD58为非常有用的MRD监测指标^{[ 33]}这一成果的启示,Coustan-Smith等^{[ 23]}利用基因芯片对初诊的B-ALL患儿和健康人骨髓中CD19⁺CD10⁺细胞的基因差异表达进行了分析,发现了22个指标（CD44、BCL2、HSPB1、CD73、CD24、CD123、CD72、CD86、CD200、CD79b、CD164、CD304、CD97、CD102、CD99、CD300a、CD130、PBX1、CTNNA1、ITGB7、CD69、CD49f）在81％的B-ALL病例中有异常表达。其中CD304^{[ 34]}和CD123^{[ 35]}也由其他研究组报道了相近的研究结果。运用新标志的检测结果与已有的FCM经典方法和PCR的结果一致。新指标的发现和应用极大地充实了已有的MRD检测抗体组合,使FCM MRD检测几乎可以覆盖所有的患者,同时有望将敏感性提高至0．001％^{[ 23]}。最近有报道表明,另一些新指标如CD81^{[ 36]}、CD49f^{[ 37]}和CD11b^{[ 38]}也可用于MRD的监测。

绝大多数MRD研究文献中,因受FCM硬件的限制而采用三色或四色抗体组合。目前,十色以上的流式细胞仪也已面市,这将更有利于白血病细胞的鉴定,进一步提高MRD检测的敏感性。研究者也可同时使用更多的参数而进一步研究残留白血病细胞的生物学特性,包括细胞增殖、凋亡、信号传导以及耐药等相关分子的表达。

除硬件的发展外,还有研究者致力于开发自动分析MRD数据的软件。Fišer等^{[ 39]}建立了基于分级群聚分析（hierarchical clustering analysis）的方法,其对于MRD的分析结果与MRD常规检测方法的结果一致,并使MRD全自动分析得以实现。不过,自动分析软件开发者必须考虑到以下事实,即检测指标的抗原表达强度在化疗过程中可能会发生改变^{[ 40]}。

最近,有研究者采用基于高速细胞图像扫描技术的方法来研究MRD^{[ 41]}。此方法可以在10⁶或更多的细胞中检出一个免疫表型异常细胞,然后通过对细胞图像的形态学检测以确认检出信号来自白血病细胞。

FCM的不足之处在于用于MRD检测的抗原的表达在治疗过程中可能会发生变化,从而造成检测结果的假阴性^{[ 7, 40]}。Gaipa等^{[ 42]}发现在儿童ALL诱导缓解治疗期间CD10和CD34表达减弱,而CD19、CD20、CD45RA和CD11a的表达增强。最近,他们又报道CD10、CD34、CD20和CD45表达强度的最初变化与用药中包含的糖皮质激素有关,而后会回复到最初的表达水平;CD11a表达的变化出现得比较晚^{[ 40]}。这种潜在的不利影响的大小取决于适用抗体组合的数量,如果有2种或2种以上的适用抗体组合存在,而抗原表达的改变并未涉及所有组合,就可有效地防止假阴性的发生。因此,MRD检测应特别强调多方法、多指标的联合应用,以期避免因监测指标发生变化而导致的假阴性。

目前,MRD检测作为个体化治疗的依据已经纳入到大多数主流的儿童ALL治疗方案中。国际上通常将0．01％作为MRD的阳性阈值,这是因为0．01％是当前常规的FCM和分子生物学技术检测MRD的检测限^{[ 22]},而且FCM和抗原受体基因重排PCR扩增法在MRD≥0．01％时,结果具有很高的一致性^{[ 3]}。许多研究组均证实了将MRD阈值设为0．01％具有临床价值。Coustan-Smith等^{[ 43]}的研究表明,在治疗过程中的任何一个时间点,骨髓中残留白血病细胞≥0．01％的患儿具有较高的复发风险。国际性的儿童肿瘤协作组（Children’s Oncology Group, COG）报道,在ALL患儿治疗第29天的骨髓MRD≥0．01％是最重要的预后指标^{[ 44]}。而采用不同治疗方案的I-BFM研究组（International Berlin-Frankfurt-Munster Study Group, I-BFM SG）报道,在治疗第33天和第78天MRD≥0．1％的ALL患儿复发率特别高^{[ 10, 45]}。Dana-Farber癌症研究院ALL协会认为,MRD阈值定为0．1％是预示复发的最好指标^{[ 46]}。

MRD的临床意义及其在危险度分层治疗中的应用与医疗机构采用的治疗方案密切相关。因此,采用不同治疗方案的医疗机构往往采用不同的MRD检测时间点、1种或2种不同的检测方法以及不同的MRD阈值进行危险度分级。最具代表性的St． Jude儿童研究医院的第XVI号方案,以治疗的第15天和第42天的骨髓中MRD水平作为危险度分级的依据^{[ 47]}。第15天,MRD≥1％的患儿将接受强化的诱导缓解治疗;MRD≥5％的患儿接受进一步强化的治疗。而MRD≤0．01％的患儿接受强度减轻的诱导治疗以及低剂量的蒽环霉素。标危ALL患儿如在第42天MRD≥0．01％,则重新划分为高危;第42天MRD≥1％者,将在首次达到缓解时进行造血干细胞移植。仅对于第42天MRD阳性的B-ALL患儿进行缓解后MRD监测,而所有的T-ALL患儿都需用外周血进行缓解后的MRD监测;MRD持续阳性或转为阳性者,将进行造血干细胞移植。

综上所述,MRD检测改变了对于ALL缓解的定义,越来越多儿童ALL的治疗方案中已经把MRD作为危险度划分的标准。此外,MRD检测还可以用于预示即将到来的复发;评估从外周血或骨髓采集的自体干细胞移植物中白血病细胞的“污染”程度,以及检测移植前的预处理过程对骨髓和外周血中白血病细胞清除的效果;还可准确评价中枢神经系统是否被白血病细胞累及;最后,MRD也已被用于评估抗白血病药物的有效性^{[ 48]},将加速有效抗白血病药物的研制。随着检测技术、软件和硬件的发展和进步,以及在检测方法简化的同时保持或进一步提高其可靠性,MRD检测必将成为白血病现代治疗理念的一个不可分割的部分。