（一）SELDI-TOF MS基本原理

SELDI-TOF MS技术的主体是蛋白质芯片、飞行时间质谱仪和相关数据软件。其基本原理是：采用化学或生物学的方法在蛋白质芯片载体表面制作点状芯池,每个芯池用探针修饰,形成化学表面芯片探针或生物表面芯片探针。将经预处理后的样本（体液、细胞、组织等）加入芯池,样本中的蛋白质分子与芯片上的探针特定结合被保留在芯片上,不能结合的蛋白质或其他物质则被特殊的缓冲液洗脱,再将能量吸收分子点加到每个芯池上,使其与蛋白质结合形成混合晶体,待芯片充分干燥后即可放入芯片阅读仪直接进行质谱检测。芯池中的分析物在芯片阅读仪内被特定频率的激光脉冲辐射解吸,发生离子化,形成荷电离子,这些离子在电场的作用下通过真空管飞到离子检测器。根据质荷比不同,离子在真空管中飞行时间也不同,质荷比越大的离子在电场中飞行的时间越长,反之则越短,据此捕获并绘制成质谱图,经相关数据软件处理后形成模拟图谱,该图谱可直观显示所获得的蛋白质的相对分子质量、含量、等电点等信息。

（二）SELDI-TOF MS技术的优势与应用

蛋白组学研究的经典技术是二维聚丙烯酰胺凝胶电泳和生物质谱技术。与传统的经典技术相比,SELDI-TOF MS技术具有以下优势：（1）样本来源广泛,可对血清及组织粗样本中的各种蛋白质进行直接检测;（2）样本用量少,每次只需要0．5~5 μL的样本;（3）可检测的相对分子质量范围较广,而且特别适合分析相对分子质量20 000以下的蛋白质;（4）具有很高的敏感性,可检测到飞摩尔水平,还可用于发现低丰度、小分子蛋白质;（5）自身携带的分析软件可以快速发现各种差异蛋白质峰,易于转化为诊断模型;（6）集蛋白质样本前处理、分离及检测分析过程于一体,可进行小型试验或高通量检测,并且可以快速获取试验结果^{[ 1, 2, 3]}。

SELDI-TOF MS技术集蛋白芯片技术和质谱技术于一体,克服了传统分析方法的局限性,具有用途广、易操作、成本低、高通量、高敏感性等优点,在医学领域中具有显著优势。目前,SELDI-TOF MS技术已被广泛应用于肿瘤、心血管疾病和神经系统疾病等的研究,并在这些领域取得令人瞩目的成果,具有广泛的应用前景。

目前SELDI-TOF MS技术应用于病原微生物研究的相关报道较少,其在病原微生物领域中的主要研究方向如下：

（一）鉴定病原微生物

目前,在临床微生物实验室鉴定病原微生物的主要方法有革兰染色镜检、菌落形态、 各种手工或自动的病原菌鉴定。这些方法依赖细菌生长代谢过程,需要孵育1~2 d,不能满足临床对感染患者快速诊断和及时治疗的需要。基于特定序列（如16S rRNA）的分子生物学检测为病原微生物鉴定提供了一种快速、敏感的鉴定方法,但技术复杂、费用高,不适用于临床微生物实验室常规鉴定。SELDI-TOF MS技术是一种简便、快速、准确、经济的鉴定病原微生物的新方法,在细菌、真菌、寄生虫的鉴定上均显示出优势。

1． 鉴定细菌 肖代雯等^{[ 4]}通过SELDI-TOF MS技术捕获到近30个大肠埃希菌蛋白峰,其中19个蛋白峰构成大肠埃希菌特征性蛋白指纹图谱,各蛋白峰在临床分离大肠埃希菌间相对分子质量变异系数≤0．2％。Yang等^{[ 5]}将SELDI-TOF MS技术用于检测金黄色葡萄球菌和对照组细菌的蛋白指纹图谱,发现了6个差异蛋白质峰,并基于这6个蛋白质峰建立了金黄色葡萄球菌诊断模型,盲法验证该诊断模型的敏感性和特异性分别为98．4％和98．6％。Xiao等^{[ 6]}用SELDI-TOF MS技术对比分析40株肺炎克雷伯菌和114株其他细菌蛋白指纹图谱,发现肺炎克雷伯菌在2 000~30 000 m／z间有30个特异蛋白质峰,利用其中最具特异性的6个蛋白质峰（相对分子质量分别为6 380、7 230、7 730、9 120、9 460和12 570）建立人工神经网络诊断模型,该模型的准确性、特异性、敏感性分别为96．9％、94．3％、100．0％。

SELDI-TOF MS不仅在病原微生物种属鉴定上有较大的突破,而且在亚种及菌株水平上的鉴定也有一定潜力。Kiehntopf等^{[ 7]}通过SELDI-TOF MS技术分别用CM10芯片和IMAC30芯片捕获到空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌、乌普萨拉弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌166和160个差异蛋白质峰。Seibold等^{[ 8]}基于SELDI-TOF MS技术联合分层聚类分析法和主成分分析法,快速、高效的鉴定出土拉热弗朗西斯菌的亚种和单个菌株。Schmid等^{[ 9]}采SELDI-TOF MS技术分析了超过350株淋病奈瑟菌菌株,并用人工神经网络模型进行数据处理,得到基于人工神经网络鉴定淋病奈瑟菌最为重要的20个差异蛋白质峰,并利用这20个蛋白质峰建立淋病奈瑟菌诊断模型,该模型的诊断效率达96．0％,特异性为97．1％,敏感性为95．7％。

2． 鉴定真菌 Pinel等^{[ 10]}先用SELDI-TOF MS分析曲霉在8种生长条件下（2种温度、2种培养基、2种氧环境、2种培养状态）的蛋白质表达情况,以确定获得SELDI-TOF MS最高分辨率的烟曲霉最适生长环境。再用SELDI-TOF MS技术分析烟曲霉、仑图卢斯曲霉和烟曲霉自然异常色素突变体的蛋白指纹图谱。试验结果证明,SELDI-TOF MS技术能成功将仑图卢斯曲霉和烟曲霉自然异常色素突变体从烟曲霉中鉴定出来。因此,研究者认为SELDI-TOF MS技术可以作为曲霉病理生理学分子机制研究的分析工具,也可能是一种强大的诊断抗原提取物的质量控制方法。

3． 鉴定寄生虫 溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）和迪斯帕内阿米巴（Entamoeba dispar） 形态相似、生活史相同,都属于内阿米巴属,但溶组织内阿米巴可引起阿米巴病,而迪斯帕内阿米巴无致病性。Makioka等^{[ 11]}用SELDI-TOF MS技术对比分析5株实验室溶组织内阿米巴（HM-1：IMSS、200：NIH、HK-9、DKB、SAW755CR）、5株日本溶组织内阿米巴（KU43、KU46、KU2、KU38、KU14）和2株迪斯帕内阿米巴（AS16IR、CYNO 09：TPC）的蛋白指纹图谱,发现各个菌株之间存在特异蛋白质峰,这些特异蛋白质峰对鉴别这2种内阿米巴有一定的价值。

SELDI-TOF MS技术从蛋白组学的角度,提供了一条快速、高效鉴定病原微生物的新途径,并在细菌、真菌、寄生虫的鉴定中取得一定进展,但在病毒的检测上至今未见报道。

（二） 寻找感染性疾病生物标志物

SELDI-TOF MS技术可以用于比较组织或器官、血浆在不同疾病状态下蛋白质表达差异,进而找到疾病相关的蛋白质作为生物标志物。生物标志物不但具有诊断效能,而且还有助于我们探索发病机制、明确疾病临床分期和预测疾病进程。

1． 细菌感染性疾病生物标志物 肺结核有着很高的发病率和死亡率,然而目前肺结核患者检出率低、漏诊率高,导致治疗延误和结核菌继续传播扩散。因此,迫切需要发现新的结核病诊断标志物,建立敏感、高效、快速的结核病诊断和鉴别诊断的新方法。Liu等^{[ 12]}用SELDI-TOF MS技术对50例肺结核患者、25例其他肺疾病患者和25名健康志愿者血清蛋白指纹图谱比较分析,发现有30个蛋白质峰在肺结核患者组与控制组之间差异有统计学意义（ P<0．01）,基于其中3个特异峰（相对分子质量分别为2 024、8 007、8 598）建立模型,诊断肺结核的敏感性和特异性分别为84．0％和86．0％。在结核分枝杆菌的研究中,SELDI-TOF MS技术已经显示出明显的优势,我们相信,随着研究的进一步深入,SELDI-TOF MS技术在其他细菌中的研究也会得到较好的发展。

2． 病毒感染性疾病生物标志物 SELDI-TOF MS技术通过寻找病毒感染性疾病生物标志物不仅可以预测和鉴别由病毒引起的感染性疾病,而且可以比较进展期患者不同阶段的蛋白指纹图谱特点。Kang等^{[ 13]}用SELDI-TOF MS技术比较74例严重急性呼吸道综合征（SARS）患者与1 067例非SARS（包括203例A型流感、176例肺炎、29例肺癌和659名健康人）血清蛋白指纹图谱,得到相对分子质量分别为3 939．08、8 136．64、11 514．2、4 157．71的最具特异性蛋白质峰,基于这4个峰应用决策树分类法分析,对SARS疾病的敏感性为97．3％,特异性为99．4％,并且能将SARS患者与流感患者区分开。SELDI-TOF MS技术为研究肝脏疾病蛋白组学提供了一个良好的技术平台。 Poon等^{[ 14]}采用SELDI-TOF MS技术对慢性乙型肝炎患者的血清进行了蛋白指纹分析,发现有30个蛋白质峰与肝纤维化程度密切相关,根据这些峰建立的人工神经网络诊断模型,能够有效地预测慢性乙型肝炎患者的肝纤维化／肝硬化程度,在一定程度上避免肝脏穿刺给此类患者带来的痛苦。Schwegler等^{[ 15]}采用SELDI-TOF MS技术对170例血清样本（39名对照者、36例无肝硬化的丙型肝炎患者、38例伴随肝硬化的丙型肝炎患者和57例丙型肝炎有关的肝细胞癌患者）进行研究,用于监测慢性丙型肝炎经历肝硬化向肝细胞癌进展过程中蛋白指纹图谱的变化,有望在可行肝细胞癌治愈性切除或移植治疗时诊断肝细胞癌,从而改善肝细胞癌患者的预后。

3． 寄生虫感染性疾病生物标志物 非洲锥虫病,又称非洲睡眠病或嗜睡性脑炎,是一种由寄生单细胞锥虫经采蝇叮咬而传播的疾病。目前诊断主要依靠患者淋巴液、脑脊液、骨髓穿刺液、淋巴结穿刺物等做涂片检查,敏感性和准确性较低。Papadopoulos等^{[ 16]}用SELDI-TOF MS技术筛选85例非洲锥虫病患者和146例对照组（由其他寄生虫和非寄生虫病患者组成）的血清差异蛋白质峰后,联合树形分类、神经网络、遗传算法3种模式识别法诊断锥虫病,诊断的敏感性和特异性分别为100．0％和98．6％。

病原菌感染机体后往往存在时间不等的潜伏期,在临床症状出现之前检出病原菌,为早期诊断和提早治疗提供了有力保障。可见,SELDI-TOF MS技术通过检测感染性疾病的生物标志物,为疾病的早期诊断和治疗开辟了一条新的道路。

（三） 病原微生物致病机制的研究

对病原微生物致病机制的研究是疾病防控过程中的重要环节。通过对同一种病原微生物的有毒株与无毒株蛋白质表达差异及病原菌与宿主相互作用过程中的蛋白质表达进行分析,可以找到涉及毒力的相关蛋白。对这些蛋白免疫机制的认识和蛋白之间相互作用的探究,将更好地揭示病原微生物在感染过程中是如何引起宿主发病的,从而为疾病的防控提供新的方法和手段。

Seo等^{[ 17]}分别用活的炭疽芽孢杆菌Sterne菌株和灭活的Sterne菌株感染人巨噬细胞,然后用SELDI-TOF MS技术对比分析巨噬细胞胞浆蛋白质图谱,得到11个差异蛋白质峰,这些差异蛋白质峰提示巨噬细胞在炭疽芽孢杆菌的存活或逃逸中起着重要作用。金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）是一种腹泻型毒素,可引起急性食物中毒。张靖等^{[ 18]}采用SELDI-TOF MS技术从蛋白质水平上研究SEB中毒的分子机制。通过分析SEB染毒小鼠与对照组小鼠血清蛋白质组的变化,发现11个标志蛋白质有显著的差异,确定的标志蛋白质可用于食物中毒诊治和SEB中毒临床诊断。此外,在研究结肠细菌微生态系统中乳糖不耐症产生的代谢途径上,He等^{[ 19]}利用SELDI-TOF MS技术研究短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌3种菌在同一碳源或同一菌在不同碳源（乳糖、葡萄糖、半乳糖）生长时蛋白质表达的差异,结果发现3种菌生长在同一碳源的蛋白质表达存在明显差异,而生长在不同碳源的同一菌株蛋白质的表达相似,但是表达强度却存在明显差异。因此,研究者认为SELDI-TOF MS技术在研究结肠微生物丛或其他细菌的微生态系统的代谢机制上有着较大的潜力。

（四） 病原微生物耐药机制的研究

病原微生物的耐药性一直是临床和实验室专家关注的问题,蛋白质组学技术可以让人们清楚地了解,在抗菌药物的作用下病原菌哪些蛋白质会发生变化以及如何变化,从而为病原菌耐药性的解决、新药的发现提供理论基础。Dubska等^{[ 20]}用SELDI-TOF MS技术分析培养时间和抗菌药物对大肠埃希菌蛋白质表达的影响,获得9种型别耐药大肠埃希菌的蛋白质图谱,为抗菌药物的抗菌治疗效果监测提供了新思路。谢贝等^{[ 21]}对比分析单耐利福平（RFP）的耐药分枝杆菌与敏感的分枝杆菌早、中期培养滤液中差异的蛋白质／多肽,发现早、中期都存在差异蛋白质／多肽,有望从中筛选到RFP耐药的特异标志物。SELDI-TOF MS技术为研究病原菌的耐药性提供了新的思路,由此可启发其他病原菌耐药问题的研究,提出解决耐药性的策略。

（五） 新型药物、潜在疫苗的研究

疾病的发生与发展、药物的作用大多是在蛋白质水平上进行的,通过对病态与正常细胞中的蛋白质进行比较,可以发现与疾病相关的蛋白质,这些蛋白质可以成为药物或疫苗筛选的作用靶标。同时,通过寻找耐药细胞系中表达异常或与细胞毒性密切相关的蛋白质,可以以此蛋白为靶点设计避免产生耐药性或毒副作用的新药物或新疫苗。

在潜在疫苗的研究上,李昂等^{[ 22]}通过SELDI-TOF MS技术比对4株牙龈卟啉单胞菌（PgATCC33277、PgW83、Pg301和Pg381）的共同外膜蛋白质图谱,得到13种共同大小相对分子质量蛋白质及其相对分子质量、等电点、相对含量等信息,这13种蛋白质可作为牙周炎疫苗候选抗原。结合疫苗是将抗原成分与某种蛋白质成分结合,以提高其免疫原性的一类新型疫苗。在结合疫苗研究中,研究者运用SELDI-TOF MS技术能实时检测轭合物的结合反应及其比例变化,从而在最佳比例下获得理想的免疫原性轭合物,这种轭合物在霍乱疫苗以及其他病原菌疫苗的研究上有着广阔的前景^{[ 23, 24]}。

在新药的研究上,Zhang等^{[ 25]}采用SELDI-TOF MS技术比较来自获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者、感染人类免疫缺陷病毒（HIV）且长期存活者和正常人的CD8 T淋巴细胞的培养上清液,发现HIV感染且长期存活者中存在一组升高的特异性蛋白质,其质量电荷比分别为3 371．9、3 442．5和3 486．5,经证实分别为α-防御素1、α-防御素2和α-防御素3。新发现的防御素很可能是一种非常有前途的治疗AIDS的方法。甲硫氨酸胺基肽酶（MAP）是细菌正常生长所必需的酶,负责切除新生肽链N端的起始甲硫氨酸可作为潜在的治疗靶点。Greis等^{[ 26]}通过SELDI-TOF MS和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）技术,在阿拉伯糖诱导获得MAP受抑制的菌株全细胞裂解液中发现了8种特异标志蛋白质（相对分子质量为4 000~14 000）,这些蛋白质可通过抑制MAP活性而抑制细菌生长,此研究结果在细菌感染治疗上有着较大的应用价值。

SELDI-TOF MS技术近几年才应用于病原微生物学的研究,在病原微生物的鉴定、生物标志物的监测、致病机制、耐药机制、新型药物、潜在疫苗的研究上取得了令人鼓舞的成果。SELDI-TOF MS技术虽然具备不可比拟的优势,但该技术在许多方面仍待完善与发展。（1）SELDI-TOF MS技术适合分析相对分子质量20 000以下的蛋白质,对相对分子质量较高的一些蛋白质检测的敏感性较低,因此并不能反映样本中所有蛋白质的信息;（2）不同实验室之间重复性较低。目前该技术系统的质量控制和标准化工作尚处于起步阶段,根据其技术特点,解决好其前期生物实验阶段的质量控制和后期数据分析阶段标准化的瓶颈问题,将推动和拓展SELDI-TOF-MS技术在研究与临床的应用^{[ 27]}。

虽然SELDI-TOF MS技术在病原微生物领域应用时间不长,还存在一些问题,但随着研究的不断深入和技术的不断完善,SELDI-TOF MS技术一定会在病原微生物领域中发挥重要作用。