引用本文
陈永琴, 金文君, 戴梦璐. 慢性乙型肝炎患者IFN-γ、IL-10和CD19+水平检测与病毒载量的关系 . 2013, 28(4): 315-317
CHEN Yongqin, JIN Wenjun, DAI Menglu. The relationship of IFN-γ,IL-10 and CD19+ levels with viral load in chronic hepatitis B patients . Labratory Medicine, 2013, 28(4): 315-317  
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慢性乙型肝炎患者IFN-γ、IL-10和CD19+水平检测与病毒载量的关系
陈永琴, 金文君, 戴梦璐
湖州中心医院检验科,浙江 湖州 313000

作者简介：陈永琴,女,1970年生,学士,副主任技师,主要从事临床血液检验工作。

摘要

目的观察慢性乙型肝炎患者免疫功能的变化,探讨患者干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素10（IL-10）和CD19+与乙型肝炎病毒（HBV）DNA载量的关系。方法 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术检测76例慢性乙型肝炎患者和30名正常人血清IFN-γ、IL-10和外周血CD19+;用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA拷贝数。结果 HBV DNA低拷贝组、高拷贝组的IFN-γ与HBV DNA阴性组比较明显下降,IL-10、CD19+与HBV DNA阴性组比较明显增高;IFN-γ水平与HBV DNA载量呈负相关（r=–0．311,P<0．05）,IL-10和CD19+的水平与HBV DNA载量呈正相关（r=0．350,P<0．05;r=0．321,P<0．05）。结论 HBV感染者存在免疫功能调节紊乱,IFN-γ、IL-10和CD19+水平的检测可作为乙型肝炎相关疾病炎症活动的观察指标。

关键词: 干扰素γ; 白细胞介素10; CD19; DNA; 乙型肝炎病毒; 慢性乙型肝炎
中图分类号:R446．62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640（2013）04-315-03
The relationship of IFN-γ,IL-10 and CD19+ levels with viral load in chronic hepatitis B patients
CHEN Yongqin, JIN Wenjun, DAI Menglu
Department of Clinical Laboratory, Huzhou Central Hospital, Zhejiang Huzhou 313000, China
Abstract

Objective To observe the change of immune function in patients with chronic hepatitis B, and to investigate the relationship of interferon-gamma（IFN-γ）, interleukin 10 （IL-10） and CD19+ with hepatitis B virus（HBV） DNA load． Methods By enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and flow cytometry, the serum IFN-γ, IL-10 and peripheral blood CD19+ levels of 76 patients with chronic hepatitis B and 30 healthy subjects were determined． By fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR）, serum HBV DNA copy number was determined． Results The IFN-γ levels in HBV DNA low copy group and high copy group decreased significantly compared with those in HBV DNA negative group． Their IL-10 and CD19+ levels increased significantly compared with those in HBV DNA negative group． The IFN-γ levels were correlated negatively with the HBV DNA load （r=–0．311,P<0．05）, and the IL-10 and CD19+ levels were correlated positively with the HBV DNA load （r=0．350,P<0．05;r=0．321,P<0．05）． Conclusions The patients have immune function adjustment disorder． The IFN-γ, IL-10 and CD19+ levels can be monitoring indices for the inflammatory of hepatitis B related diseases．

Keyword: Interferon-gamma; Interleukin 10; CD19; DNA; Hepatitis B virus; Chronic hepatitis B
引言

慢性乙型肝炎的发病机制非常复杂。目前大多数学者认为乙型肝炎病毒（HBV）感染机体后不直接引起肝损伤,而是与HBV介导的免疫损伤有关。乙型肝炎引起的免疫反应主要有T细胞介导,辅助性T淋巴细胞（Th）可以分为Th1和Th2 2个主要亚群,Th1细胞分泌干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）等细胞因子,介导细胞免疫;Th2细胞主要分泌白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素10（IL-10）等细胞因子,可刺激B细胞增生介导体液免疫;而CD19+细胞代表B淋巴细胞。但机体的免疫状态与血清中HBV DNA载量的关系,目前仍不是很清楚。我们通过检测慢性乙型肝炎患者的IFN-γ、IL-10和CD19+水平与HBV DNA载量来探讨他们之间的关系,为临床提供参考。

材料和方法
一、 材料

1． 研究对象 随机选取2009年8月至2011年3月门诊及住院慢性HBV感染患者血清标本76例,男48例,女28例,年龄18~61岁。其中HBV DNA阴性组（<103拷贝／mL）28例,低拷贝组（103~106拷贝／mL）26例,高拷贝组（>106拷贝／mL）22例,诊断符合2005年第十二次全国病毒性肝炎及肝病学术会议通过的《慢性乙型肝炎防治指南》,排除其他嗜肝病毒感染,无心、脑、肾等重要器官疾病。正常对照组30名,男19名,女11名,年龄20~62岁,均为体检中心体检合格的健康者,无其他肝炎病毒感染。各组间性别、年龄差异无统计学意义。

2． 标本来源 采集患者空腹静脉血3 mL,离心取上层血清存放于–70 ℃冰箱待检;采3 mL静脉血检测HBV DNA,另采2 mL乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝静脉血检测CD19+。

3． 试剂与仪器 检测血清中IFN-γ、IL-10的仪器为日本松下电器生产的酶标仪MK3（试剂由北京博奥森生物有限公司提供）;CD19+由贝克曼Epics XL流式细胞仪检测[CD19-藻红蛋白（PE）单抗试剂来自美国COULTER原装配套];HBV DNA由ABI-7500 荧光定量核酸扩增仪检测[聚合酶链反应（PCR）试剂来自深圳匹基生物工程公司]。

二、方法

1． 血清IFN-γ、IL-10检测 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体法检测试剂盒,严格按照试剂盒使用说明书操作,使用酶标仪450 nm检测吸光度（ A）值,通过标准曲线计算标本中的浓度。

2． CD19+检测 取100 μL抗凝血于流式专用试管中,加入20 μL CD19+-PE荧光标记抗体。室温避光反应20 min,加入500 μL红细胞裂解液,溶解红细胞15 min,加入500 μL鞘液混匀,200× g离心5 min,弃上清液,再加入500 μL鞘液,混匀后上机检测荧光抗体染色阳性CD19+百分率。

3． HBV DNA定量检测 采用荧光定量PCR扩增,严格按照试剂使用说明书操作;每次HBV DNA检测均设阳性梯度模板、阴性对照及空白对照。HBV DNA阴性值<103拷贝／mL。

三、统计学方法

采用SPSS 13．0统计软件进行分析,计量资料以 x- ±s表示,用 t检验及相关性分析进行统计, P<0．05表示差异有统计学意义。

结果
一、 慢性乙型肝炎患者血清IFN-γ、IL-10和CD19+检测

慢性乙型肝炎组患者IFN-γ、IL-10、CD19+水平明显高于正常对照组（ P<0．05）。见 表1。

表1 慢性乙型肝炎组与对照组IFN-γ、IL-10和CD19的检测结果（ x- ±s）
二、慢性乙型肝炎患者血清IFN-γ、IL-10和CD19水平与HBV DNA载量的关系

IFN-γ水平与HBV DNA载量呈负相关（ r=–0 ．311, P<0．05）,IL-10、CD19+水平与HBV DNA载量呈正相关（ r=0 ．350, P<0 ．05; r=0 ．321, P<0．05）。见 表2。

表2 IFN-γ、IL-10和CD19+与HBV DNA载量的关系（ x- ±s）
讨论

一般认为,HBV感染人体后引起的肝脏和其他脏器病变以及疾病的发生、发展并非病毒本身所致,而与人体的免疫状态有关。作为免疫系统中细胞间相互作用的信号分子,细胞因子在免疫应答、免疫调节和炎症反应中都有重要作用,Th细胞是分泌产生细胞因子的主要细胞之一,对机体的特异性和非特异性免疫,对细胞免疫和体液免疫均有重要的调节作用。在慢性乙型肝炎患者体内,Th1／Th2细胞不平衡应答可能是感染慢性化的主要机制,这种失衡又体现在细胞因子失调上[ 1]。

INF-γ是在免疫应答过程中由Th1细胞和自然杀伤（NK）细胞产生的具有高度生物活性的一种细胞因子。抑制Th2细胞增殖分化,以往认为其具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节三大功能。国外学者报道在黑猩猩中发现HBV DNA水平的下降伴随着INF-γ的增加[ 2]。本研究结果表明,慢性乙型肝炎患者血清INF-γ水平与HBV DNA载量呈负相关（ r=–0 ．311, P<0．05）,且随着IFN-γ水平增高,HBV DNA载量逐渐降低,差异有统计学意义,提示IFN-γ与HBV的清除有关,其可激活肝细胞自身抗病毒机制,抑制HBV DNA复制,与相关报道一致[ 3]。

IL-10主要由Th2细胞产生,其在免疫反应中主要通过抑制Th1细胞产生细胞因子IFN-γ、IL-2、白细胞介素3（IL-3）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等,抑制Th1细胞应答,并有抗炎和诱导免疫耐受的作用。本研究结果与吴戊年[ 4]报道一致,随着血清IL-10水平的增高,HBV DNA载量也逐渐增高,差异有统计学意义（ r=0 ．350, P<0．05）,提示Th2细胞因子IL-10抑制Th1细胞应答,使机体不能有效清除受病毒感染的肝细胞,造成HBV感染的持续,与乙型肝炎慢性化有关。

CD19+是B细胞表面的糖基化Ⅰ型跨膜蛋白,是B细胞限制性抗原,可代表B淋巴细胞水平[ 5]。B淋巴细胞是机体体液免疫重要组成部分,在受到体内或体外抗原刺激后进而增殖产生免疫应答,B细胞产生高滴度的抗体需Th细胞辅助。本研究显示,随着外周血CD19+增高,HBV DNA载量也逐渐增高,差异有统计学意义（ r=0 ．321, P<0．05）。说明体液免疫在慢性乙型肝炎的病程中起到关键作用,B淋巴细胞产生的抗体能对血液中的HBV进行反应加以杀灭。

综上所述,通过对慢性乙型肝炎患者的IFN-γ、IL-10和CD19+水平检测,可以了解其与HBV DNA载量的相关性,了解机体对HBV的免疫应答程度和特点,他们的水平可能与免疫病理性肝损伤有关,为临床疾病观察提供试验指标。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[2] Zhang LJ, Yu JP, Li D, et al. Effects of cytokines on carbon tetrachloride-induced hepatic fibrogenesis in rats[J]. World J Gastroenterol, 2004, 10(1): 77-81. [本文引用:1]
[3] 杨仲国, 陈岳明, 方美玉, 等. 慢性乙型肝炎患者血清病毒载量与IFN-γ和IL-4含量关系探讨[J]. 中国医师杂志, 2002, 4(8): 835-836. [本文引用:1]
[4] 吴戌年. 慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA含量与IL-8、IL-10水平检测及临床意义[J]. 兰州大学学报(医学版), 2005, 31(1): 30-32. [本文引用:1]
[5] 王京旭, 魏平, 王俊祥, 等. 类风湿关节炎患者外周血CD23+／CD19+细胞表达状况的研究[J]. 临床荟萃, 2009, 24(23): 2031-2033. [本文引用:1]