引用本文
王志林, 姚玉华, 李桑, 孙冠星. 弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫表型分类与c-MYC重排的相关性研究 . 2013, 28(4): 308-311
WANG Zhilin, YAO Yuhua, LI Sang, SUN Guanxing. Research on correlation between immunophenotype andc-MYC rearrangement in diffuse large B-cell lymphoma . Labratory Medicine, 2013, 28(4): 308-311  
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弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫表型分类与c-MYC重排的相关性研究
王志林1, 姚玉华2, 李桑1, 孙冠星1
1． 常州市第一人民医院血液实验室,江苏 常州 213003
2． 常州市第一人民医院检验科,江苏 常州 213003

作者简介：王志林,男,1972年生,硕士,副主任技师,主要从事血液病研究。

摘要

目的探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）免疫表型分类与c-MYC重排的相关性。方法 根据淋巴瘤细胞免疫标志物CD10、B细胞淋巴瘤原癌基因-6（BCL-6）及多发性骨髓瘤原癌基因-1（MUM-1）的表达情况,将46例DLBCL分为生发中心B细胞样（GCB）与非生发中心B细胞样（non-GCB）2类,用荧光原位杂交（FISH）技术检测GCB类与non-GCB类中c-MYC重排情况。结果 46例标本中共有4例（8．7％）发生c-MYC重排,其中20例GCB类中发现4例（20．0％）c-MYC重排,而26例non-GCB类中未发现c-MYC重排。GCB类和non-GCB类中c-MYC重排差异有统计学意义（P<0．05）。结论 GCB类DLBCL 患者c-MYC重排发生率较高,c-MYC重排是一部分GCB类DLBCL预后差的原因。FISH技术能快速、准确、灵敏地检测出c-MYC重排。

关键词: c-MYC重排; 弥漫性大B细胞淋巴瘤; 荧光原位杂交
中图分类号:R446．62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640（2013）04-308-04
Research on correlation between immunophenotype andc-MYC rearrangement in diffuse large B-cell lymphoma
WANG Zhilin1, YAO Yuhua2, LI Sang1, SUN Guanxing1
1． Department of Hematology, the First People#cod#x02032;s Hospital of Changzhou,Jiangsu Changzhou 213003,China
2． Department of Clinical Laboratory,the First People#cod#x02032;s Hospital of Changzhou,Jiangsu Changzhou 213003,China
Abstract

Objective To investigate the correlation between immunophenotype andc-MYC rearrangement in diffuse large B-cell lymphoma （DLBCL）． Methods According to the lymphoma cell immune marker CD10,B cell lymphoma 6 （BCL-6） and multiple myeloma oncogene 1 （MUM-1） expression levels,46 cases of DLBCL were classified into germinal center B cell-like（GCB） group and non-germinal center B cell-like（non-GCB） group．c-MYC rearrangement status was analyzed by fluorescence in situ hybridization （FISH） in GCB and non-GCB groups． Results Of the 46 DLBCL cases,4 cases （8．7％） hadc-MYC rearrangement． The 4 cases ofc-MYC rearrangement belonged to the GCB group． There was noc-MYC rearrangement in non-GCB group． Thec-MYC rearrangement had statistical significance between GCB and non-GCB groups （P<0．05）． Conclusions The GCB group in patients with DLBCL has a highc-MYC rearrangement,andc-MYC rearrangement is a poor predictor for a part of GCB group． FISH is a rapid,accurate and sensitive technique for the detection ofc-MYC rearrangement．

Keyword: c-MYC rearrangement; Diffuse large B-cell lymphoma; Fluorescence in situ hybridization
引言

弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）最常见的组织学类型[ 1],占成人淋巴瘤的30％~40％。根据基因表达特征可将DLBCL分成2种亚型：一种为生发中心B细胞样（germinal center B-cell-like,GCB）;另一种为非生发中心B细胞样（non-GCB）,又称活化B细胞样（activated B-cell-like,ABC）[ 2]。也可以利用CD10、B细胞淋巴瘤原癌基因-6（BCL-6）及多发性骨髓瘤原癌基因-1（MUM-1）免疫标志物来对DLBCL进行分类：CD10（+）则为GCB类,当CD10（–）且BCL-6（–）时则为non-GCB类;若CD10（–）、BCL-6（+）时则要检测MUM-1,如果MUM-1（+）则为non-GCB类,反之为GCB类DLBCL[ 3]。 c-MYC是一种原癌基因,与细胞周期密切相关[ 4]。关于DLBCL患者中 c-MYC重排情况国内未见相应报道,为此我们应用荧光原位杂交（FISH）技术检测了DLBCL患者 c-MYC重排情况。

材料和方法
一、研究对象

收集来自常州市第一人民医院病理科2009年5月至2011年3月诊断明确的DLBCL标本共46例,所有病例诊断均符合2001年世界卫生组织（WHO）淋巴瘤分类标准：DLBCL形态表现为弥漫增生的大淋巴细胞,瘤细胞核的体积比正常小淋巴细胞大2倍以上或等于及超过巨噬细胞核,核呈空泡状,核仁明显,核分裂相易见。这些标本已经用CD10、BCL-6、MUM-1 3种免疫标志物进行了分类。选择8例扁桃体反应性增生患者标本作为对照组,DLBCL组和对照组同时做FISH检测。

二、方法

1． 免疫组化染色步骤 免疫组化试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司,采用常规免疫组化检测方法。结果判读采用北京中杉金桥生物技术有限公司阳性结果判断标准：CD10阳性定位于细胞膜,BCL-6、MUM-1阳性定位于细胞核,以>20％的肿瘤细胞着色判为阳性。

2． FISH技术 试剂为北京金菩嘉医疗科技有限公司生产,GLP MYC探针位于8q24,采用SpecteumGreen和SpecteumRed标记的DNA序列,在正常间期细胞中表现为2个黄色融合信号,出现相互分离的橘红色信号、绿色信号和一个黄色融合信号或2个橘红色信号和2个绿色信号判断为阳性。

具体步骤：取出用4％甲醛固定、石蜡包埋的组织标本,使用切片机切下2~3 μm的石蜡片。根据苏木精-伊红（HE）染色,选择富含淋巴瘤细胞的区域,用钻石笔在切片背后做标记（画小圆圈）以示所需杂交的位置。而在反应性增生的扁桃体的切片背后也标记好组织所在的部位。然后对做好标记的切片进行烤片至产生小蜡珠,脱蜡,二甲苯浸泡各2次,每次10 min。100 ％乙醇浸泡5 min,洗去二甲苯;复水,100 ％、85 ％、70 ％乙醇浸泡2 min;煮片,在高压锅中煮10 min;消化,胃酶,40 mL蒸馏水中400 μL 1 mol／L HCl,然后加入240 μL的20 mg／mL胃蛋白酶,不同样本的时间不同,一般是30~60 min;2×氯化钠-柠檬酸钠溶液（SSC）,脱水2次各5 min;甲醛固定10 min;脱水,70 ％、85 ％、100 ％乙醇脱水各2 min。

探针处理：每份标本取探针1 μL,加杂交稀释液4 μL混匀,将探针混合液5 μL加于玻片的待杂交区,盖上盖玻片。用Rubber Cement封片后,放于ThermoBrite自动原位杂交仪中,程序设定83 ℃变性5 min,42 ℃杂交20 h。杂交结束后,洗片,去除盖玻片,将玻片置于46 ℃的0．3 ％ NP-40／0．4×SSC中洗涤2 min,再置于室温0．1％ NP-40／2×SSC 中洗涤45 s,置于2×SSC中脱水4 min,再置于70 ％的酒精中脱水4 min,取出玻片,晾干,复染,吸取10 μL的4,6二脒基-2-苯吲哚盐酸（DAPI）于杂交区,置于4 ℃冰箱,待30 min后观察结果。

检测：用OLYMPUS BX51正置荧光显微镜在DAPI／FITC／RHOD滤光片的激发下,观察细胞红色和绿色荧光杂交信号,每份标本至少分析100个细胞,计数边界清楚、无重叠、结构完整的细胞核,用德国耶拿CCD摄像头进行图像采集,使用IMSTAR软件进行图像分析。

三、统计学方法

使用SPSS 13．0统计学软件进行分析,计数资料采用校正的 χ2检验, P<0．05为差异有统计学意义。

结果
一、判断 c-MYC重排的标准

8例扁桃体反应性增生的标本细胞核中GLP MYC杂交信号为2个红色荧光和绿色荧光相邻重叠的黄色信号,见 图1,如发生 c-MYC重排,则MYC荧光信号断裂成红色和绿色2个荧光杂交信号,即红色和绿色荧光杂交信号标分离。每份标本分析200个细胞,出现红色和绿色荧光杂交信号相分离的细胞是 c-MYC重排假阳性细胞,以阳性细胞数> x- +3 s作为标准, c-MYC重排的阳性标准>2．1％。

图1 c-MYC信号正常

二、病例组 c-MYC重排情况

46例DLBCL患者中20例（43．5％）为GCB类,26例（56．5％）为non-GCB类。46例DLBCL患者中有4例（8．7％）发现有 c-MYC重排,4例（20．0％）均为GCB类患者,其中1例患者为 c-MYC重排伴扩增,细胞阳性率为15％~52％;non-GCB类中未发现 c-MYC重排的患者, GCB类和non-GCB类 c-MYC重排差异有统计学意义（ χ2 =5．695,P<0．05）,GCB类中 c-MYC重排率较高。见 图2、 图3。

图2 c-MYC重排

图3 c-MYC重排同时扩增

讨论

DLBCL是WHO分类中最常见的高度恶性淋巴瘤,只有40％~50％的患者可获得缓解,提示DLBCL可能存在不同类型[ 5]。由于该肿瘤临床表现多样,病理形态及遗传学特征复杂,长期以来对其分型和预后判断存在认识上的分歧。DLBCL在细胞起源、基因表达、分子遗传学特点、免疫表型及临床表现方面均有明显的异质性,不同的DLBCL其治疗反应不同,预后也不同,因此对DLBCL进行分类尤为重要。

2000年以来,经DNA微阵列和免疫组化研究发现,依据基因表达谱和免疫表型可初步将DLBCL分为GCB和non-GCB两大类型。这2类基因表达不同的DLBCL,其5年生存率分别为70％和12％,GCB类DLBCL的预后明显好于non-GCB类型[ 2, 3]。

c-MYC基因定位于8q24,由3个外显子及2个内含子组成,第1个外显子不编码,只起调节作用,只有外显子2和3是编码区,外显子1、2、3共同编码的蛋白质定位于核内,为核转录调节因子。 c-MYC编码的蛋白通过螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链（bHLH-LZIP）区与同样含有bHLH-LZIP结构的MAX蛋白形成异二聚体,特异地识别其靶基因DNA序列中的CACGTG核心序列,并与之结合,使被调节的基因激活或转录增强。 c-MYC重排后,导致 c-MYC编码的蛋白过度表达,从而影响一些涉及细胞周期调节、凋亡、细胞生长和分化、细胞代谢和细胞黏附的转录,涉及细胞生长的一些基因异常表达,导致细胞异常增生[ 4]。

本研究46例DLBCL患者中有4例发生 c-MYC重排,阳性率为8．7％,与文献报道一致[ 6, 7]。4例（20．0％）发生 c-MYC重排的DLBCL均为GCB类,26例non-GCB类DLBCL患者均没有发现 c-MYC重排,两者比较,差异有统计学意义（ P<0．05）。但有研究指出GCB类和non-GCB类中发生 c-MYC重排的差异并没有统计学意义[ 7],可能和我们研究的病例数太少或种族上的差异有关。

国外研究发现,发生 c-MYC重排的患者Ki-67高表达[ 7],Ki-67为细胞增殖的一种标记,在细胞周期的G、S、G2和M期中表达,Ki-67阳性细胞比率反映了进入细胞周期的增生细胞比率,其高表达往往与肿瘤的预后不良相关。我们研究的4例 c-MYC重排患者Ki-67均高表达。

用利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、阿霉素和泼尼松方案（R-CHOP）化疗,发现 c-MYC重排阳性的DLBCL患者预后均比较差[ 6, 7, 8, 9],其阳性患者无进展生存期（PFS）显著差于阴性者,中枢复发风险高,生存率显著差于阴性者。由于 c-MYC重排阳性预后差,有人认为发生 c-MYC重排的DLBCL是一独特亚型[ 7]。部分GCB类的DLBCL患者预后比较差,可能与 c-MYC重排有关。

与其他恶性肿瘤一样,DLBCL的发生是复杂的、多步骤的过程。在这一过程中,往往涉及染色体易位、癌基因扩增重排、抑癌基因缺失或突变等各方面,如TP53缺失、BCL-6重排等[ 10, 11],多基因病变逐渐累积,最终形成恶性克隆。 c-MYC重排仅仅是部分DLBCL发病步骤中重要的一环。

FISH技术是将已知核酸序列作为探针,以荧光素直接标记或先以非放射性物质标记后与靶DNA进行杂交,再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物,最后在荧光显微镜下观察杂交信号,从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析的方法。该技术广泛应用于优生优育、血液病的研究。

为了研究DLBCL患者发生 c-MYC重排情况,我们把FISH技术运用于石蜡包埋组织切片上,该技术具有敏感性和特异性高、只需要较少组织、定位准确等优点。如果在肿瘤组织中,肿瘤细胞分布不均匀或肿瘤细胞间加杂有很多反应性增生成分时,可先根据HE切片定位富含有肿瘤细胞的区域做以标记,然后再与所需探针杂交,从而提高检测的正确性。总之,在石蜡包埋组织切片上进行的FISH技术,是简单易行的、经济的、可与组织形态学相结合的技术。我们可以预见FISH技术能在淋巴瘤的诊断、治疗、预后以及机制研究等方面发挥越来越大的作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

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