引用本文
朱岚, 黄飚, 张珏, 陈永伟, 李跃松. 甲状腺球蛋白抗体竞争TRFIA技术的建立及临床应用. 2013, 28(4): 305-307
ZHU Lan, HUANG Biao, ZHANG Jue, CHEN Yongwei, LI Yuesong. Establishment of TRFIA for anti-thyroglobulin antibody and its clinical application. Labratory Medicine, 2013, 28(4): 305-307  
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甲状腺球蛋白抗体竞争TRFIA技术的建立及临床应用
朱岚, 黄飚, 张珏, 陈永伟, 李跃松
江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室,江苏 无锡 214063

作者简介：朱岚,女,1979年生,学士,助理研究员,主要从事临床免疫分析研究。

摘要

目的建立甲状腺球蛋白抗体（TgAb）时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）竞争检测法。方法 用甲状腺球蛋白抗原包被96孔板,用铕（Eu3+）标记羊抗鼠IgG做标记物,TRFIA检测人血清中的TgAb。结果 TgAb-TRFIA的敏感性为1．0 IU／mL;批内变异系数（CV）为3．3％~4．1％,批间CV为3．7％~4．7％;平均回收率为97．9％;热稳定性好;与电化学发光分析技术（ECLIA）比对,相关系数达0．881 3;男女TgAb测定值差异无统计学意义;TgAb的正常值范围为≤110 IU／mL。结论 建立的TgAb-TRFIA是一个高敏感和可靠的检测方法,有助于甲状腺疾病的临床诊断。

关键词: 时间分辨荧光免疫分析; 甲状腺球蛋白抗体; 甲状腺疾病
中图分类号:R446．61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640（2013）04-305-03
Establishment of TRFIA for anti-thyroglobulin antibody and its clinical application
ZHU Lan, HUANG Biao, ZHANG Jue, CHEN Yongwei, LI Yuesong
Jiangsu Institute of Nuclear Medicine, Key Laboratory of Nuclear Medicine, Ministry of Health, Jiangsu Wuxi 214063, China
Abstract

Objective To establish a time-resolved fluoroimmunoassay（TRFIA）for anti-thyroglobulin antibody（TgAb）． Methods The thyroglobulin antigen was coated on the 96 well plates． A goat anti-mouse IgG-europium （Eu3+） was used to the detection． Serum TgAb level was detected by TRFIA． Results The sensitivity was 1．0 IU／mL． The within-run coefficient of variation （CV）was 3．3％- 4．1％． The between-runCV was 3．7％- 4．7％． The average recovery was 97．9％． The kit was stable． The correlation coefficient with TgAb by electrochemiluminescence immunoassay （ECLIA） was 0．881 3． The TgAb levels between males and females had no statistical significance． The normal range of TgAb was ≤ 110 IU／mL． Conclusions The established TRFIA for the detection of TgAb in serum is a sensitive and reliable assay, which would be useful for the clinical diagnosis of thyroid diseases．

Keyword: Time-resolved fluoroimmunoassay; Anti-thyroglobulin antibody; Thyroid disease
引言

甲状腺球蛋白抗体（anti-thyroglobulin antibody,TgAb） 是一种重要的抗甲状腺自身抗体,其异常增高常见于桥本病（Hashimoto′s disease,HD）等自身免疫性甲状腺疾病,然而临床上亦见于并不伴有HD 的甲状腺癌（thyroid cancer,TC）、甲状腺腺瘤（thyroid adenoma,TA）和结节性甲状腺肿（nodulargoiter,NG）等疾病[ 1, 2, 3]。目前市场上的TgAb定量试剂盒多由国外进口,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光法测定[ 4],经过探索和研究,本室创建了新型超敏感的TgAb时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA）检测法。

材料和方法
一、材料

1． 标本 取自江苏省江原医院住院和门诊患者血清151例（患者均无心、肝、肺、肾等疾病,年龄27~68岁,平均年龄43．6岁）、正常体检人员血清252例（受检者年龄23~65岁,平均年龄39．7岁）。

2． 试剂和仪器 羊抗鼠IgG（华美生物工程公司产品）;甲状腺球蛋白抗原、TgAb（Medix公司,鼠源）;防腐剂（Proclin-300,SUPELCO公司）、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯（Tween 20,Sigma公司）;牛血清白蛋白（BSA,深圳晶美生物工程有限公司）;铕（Eu3+）标记盒（PE公司）;凝胶过滤柱（Sepharose CL-6B,Pharmacia公司）。TgAb国家标准品（150556-200601,中国药品生物制品检定所）。96孔微孔板（Nunc公司）。洗脱液、增强液、洗涤液、质控品均为自配,其他试剂均为国产分析纯。冻干机（上海东富龙冷冻干燥设备公司）。DELFIA1235全自动TRFIA检测仪（PE公司）。

二、方法

1． TgAb标准品的配制 收集临床测定的TgAb高值血清,其乙型肝炎病毒抗原（HBV-Ag）、丙型肝炎病毒抗体（抗HCV）、人类免疫缺陷病毒抗体（抗HIV）均阴性,合并,加防腐剂（Proclin-300）适量。经反复冻融、离心、过滤等处理后得到标准品原液,用人去激素血清（含0．1％叠氮钠）配制成不同浓度的标准品,与用TgAb国家标准品配制成的已知浓度的校准品同时测量,校准各标准点的浓度,1 mL／瓶分装,冻干,–20 ℃保存[ 3]。

2． 固相抗原包被板的制备 甲状腺球蛋白抗原用50 mmol／L Na2CO3-NaHCO3 pH值9．6缓冲液稀释至合适浓度,200 μL／孔包被,振荡30 min,4 ℃过夜。弃包被液,每孔加250 μL 含有10％ BSA的上述缓冲液封闭2 h,真空抽干,密封,置–20 ℃保存。

3． Eu3+-羊抗鼠IgG的制备 1 mg的羊抗鼠IgG加入含有1 mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸（Eu3+-DTTA）冻干粉的小瓶中,25 ℃磁力搅拌反应20 h。反应液经用80 mmol／L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）-HCl pH值7．8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱（1 cm×40 cm）层析,控制流速为2 mL／min,每管收集2 mL,吸光度（ A）280监测收集第一蛋白峰。

4． 竞争TgAb-TRFIA检测方法 在包被甲状腺球蛋白抗原的微孔反应板中加入100 μL样本和100 μL用分析缓冲液稀释的TgAb,25 ℃振荡1 h,洗涤4次,再加入200 μL用分析缓冲液稀释的Eu3+-羊抗鼠IgG,25 ℃振荡0．5 h,洗涤4次,再加入增强液200 μL, 25 ℃振荡反应5 min后检测。该过程由DELFIA1235全自动TRFIA检测仪自动完成。

三、统计学方法

TgAb-TRFIA标准曲线分析[有效剂量（ED）、变异系数（ CV）等]及结果由DELFIA全自动TRFIA检测仪随机配备的Multicalc软件自动给出。应用SPSS 12．0统计软件进行 t检验和相关回归分析, P<0．05为差异有统计学意义。

结果
一、条件优化

1． 固相甲状腺球蛋白抗原包被浓度 包被浓度分别为0．125、0．25、0．5、1．0、2．0、4．0、8．0 μg／mL,进行TgAb-TRFIA,结果显示2 μg／mL包被板时检测其零浓度点的结合率较高,曲线的斜率最大。所以选择甲状腺球蛋白抗原2 μg／mL浓度包板,达到获得良好免疫反应的条件。

2． 抗体稀释比例选择 在96孔微孔板中加入用分析缓冲液稀释的不同浓度的TgAb。结果表明,30％~50％抗体结合率对应的稀释度约为1∶2 000~1∶4 000倍。我们选择1∶2 000 倍抗血清稀释度为建立竞争抑制免疫分析的工作浓度。

二、方法学鉴定

1． TgAb-TRFIA标准品定值 以国家标准品为标准对照,定标品实际浓度与标示浓度回归方程为 Y=1 ．013 2 X–0 ．531 2（ r=0 ．999 9, P<0．05）。

2． TgAb-TRFIA标准曲线 采用Log／Log_B 数学拟合模式,以标准品含量对数值为横坐标,相应反应孔荧光计数（CPS）的对数值为纵坐标,绘制剂量-反应曲线,方法学线性范围为0~40 001．0 IU／mL。见 图1。

图1 TgAb-TRFIA标准曲线

3． 敏感性 重复测定零剂量点（20次）,以 x- –2 s的荧光值在曲线上得到相应的浓度为检测低限,则本方法的检测低限为1．0 IU／mL。

4． 健全性 将TgAb浓度分别为298、584和3 562 IU／mL的3份血清进行倍比稀释,经测定稀释倍数与样本含量呈线性关系,相关系数分别为0．999 6、0．999 8、0．999 9;相关方程分别为 Y=298 ．69 X–1 ．92、 Y=587 ．22 X+0 ．30、 Y=3 568 ．71 X+1 ．17,表明本法具有良好的健全性。

5． 精密度 取本实验室自备的低、中、高浓度的TgAb质控冻干品各20份,批内、批间（20例）试验数据见 表1。

表1 批内、批间试验数据表（20例）

6． 准确度 取含量为36．7 IU／mL的TgAb血清分别加到50、100、1 000 IU／mL标准参考品中进行回收试验。回收率分别为99．1％、97．3％、97．3％,平均回收率为97．9％。

7． 稳定性试验 将该试剂盒置于37 ℃ 7 d和4 ℃保存的整套试剂盒,双孔平行对比检测标准参考品,结果相关性良好（ Y=0 ．938 7 X–0 ．971 7, r=0 ．999 9, P<0 ．05）。

三、临床考核

1． 比对试验 用TgAb-TRFIA与电化学发光分析技术（ECLIA）[ 4]平行测定175例样本（其中24例甲状腺功能正常、64例HD、45例Graves病、19例TC、23例NG）,结果2种方法之间相关性良好（ r=0 ．881 3, P<0．05）,见 图2。

图2 TgAb-TRFIA与TgAb-ECLIA 对比曲线

2． 正常值范围 选择252例正常人血清样本,其甲状腺自身抗体阴性（包括TgAb）,无甲状腺疾病史,未触及甲状腺肿,未服用除雌激素外的药物[ 4, 5]。结果显示男女TgAb平均值分别为107和110 IU／mL,差异无统计学意义（ P>0．05）,故合并为正常对照组,正常值取99％可信限,其参考值范围为≤110 IU／mL。

讨论

TRFIA是20世纪80年代发展起来的一种公认的最有发展前途的非放射免疫标记技术,具有敏感性高、特异性强、稳定性好、测定范围宽、操作简便等优点。本法的同类试剂盒有PE公司的TgAb-TRFIA试剂盒,但其采用的是间接法,由于正常血清中含高浓度的非特异性抗体,患者血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分,而IgG的吸附性很强,非特异IgG可直接吸附到固相载体上,有时也可吸附到包被抗原的表面,在检测过程中样本须先行稀释（1∶40~1∶200）,以避免过高的阴性本底影响结果的判断,但这种干扰因素还是有可能造成假阳性反应的,而且间接法成功的关键在于抗原的纯度,这就会使试剂盒的成本居高不下。

本法是基于微孔板免疫学竞争法的原理,用甲状腺球蛋白抗原包被板,在孔中加入标准参考品（或样本）及特异性的鼠源TgAb,同时竞争抗原的结合位点,再加入的Eu3+-羊抗鼠IgG可以结合到鼠源的TgAb上,形成抗原- TgAb-Eu3+标记羊抗鼠IgG的多层免疫复合物,加入增强液,微孔表面免疫复合物中的Eu3+被荧光增强液解离并形成稳定的荧光配合物,在TRFIA检测仪上测定相应发光强度。根据已知TgAb浓度的系列标准品的相应发光强度可得到标准曲线,未知样本的TgAb浓度可以通过其相应发光强度从曲线上反算出来,样本中的TgAb浓度与发光强度呈反比。

本法采用竞争原理测定TgAb,即样本中的抗体和一定量的TgAb共同竞争与固相抗原结合,再用Eu3+标二抗来示踪TgAb的量。这样就避免了间接法中的干扰因素,而且由于竞争法抗原的包被浓度降低,使成本降低;血清样本也不需要预稀释,减少临床操作工序,减轻工作强度。该法敏感性达1．0 IU／mL,精密度良好（批内 CV分别为3．3％~4．1％,批间 CV分别为3．7％~4．7％）,平均回收率为97．9％,热稳定性好,与ECLIA比对,两法之间相关性良好（ r=0．881 3）,与临床结果的一致性好,该法成本不高,具有良好的应用价值[ 5, 6]。

样本采用静脉采血于凝血管中[可使用肝素,但不能使用乙二胺四乙酸（EDTA）或枸橼酸盐作抗凝剂],2~8 ℃条件下,样本可保存7 d,–20 ℃可长期保存,但要避免样本反复冻融。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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