引用本文
陈永秀, 周云珍, 陈锦宏, 李树全, 龙桂芳. 两种电泳方法血红蛋白分析一致性的比较. 2013, 28(3): 229-232
CHEN Yongxiu, ZHOU Yunzhen, CHEN Jinhong, LI Shuquan, LONG Guifang. Comparison on the consistency of two electrophoresis methods in the detection of hemoglobin. Labratory Medicine, 2013, 28(3): 229-232  
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《检验医学》编辑部
两种电泳方法血红蛋白分析一致性的比较
陈永秀1, 周云珍2, 陈锦宏3, 李树全4, 龙桂芳4
1.横县人民医院检验科,广西 横县 530300
2.横县人民医院产科,广西 横县 530300
3.横县人民医院血液科,广西 横县 530300
4.广西医科大学第一附属医院血红蛋白研究室,广西 南宁 530021

作者简介:陈永秀,女,1968年生,主管技师,主要从事临床地中海贫血筛查工作

摘要
目的

比较琼脂糖凝胶电泳与醋酸纤维素薄膜电泳血红蛋白检测结果的一致性。

方法

同时采用Sebia Hydrasys LC全自动琼脂糖凝胶电泳系统和醋酸纤维素薄膜电泳(pH值8.6)对4 126例进行地中海贫血筛查的样本进行血红蛋白各组分的检测。用分光光度计比色测定HbA2、HbH、HbBart's含量,用碱变性试验检测HbF含量。对2种电泳方法的检测结果进行对比,不一致的样本采用基因分析确诊。

结果

4 126例样本中琼脂糖凝胶电泳共检出β-地中海贫血686例(HbA2和/或HbF增高)、α-地中海贫血321例(HbA2降低);醋酸纤维素薄膜电泳检出β-地中海贫血683例、α-地中海贫血 323例。2种电泳方法对HbA2和HbF区带的检测能力基本一致。琼脂糖凝胶电泳检出HbH 103例、HbBart's 71例、HbCS 63例;醋酸纤维素薄膜电泳检出HbH 141例、Hb Bart's 101例、HbCS 65例。经基因分析确诊,琼脂糖凝胶电泳漏检HbH 38例、HbBart's 30例、HbCS 2例。

结论

琼脂糖凝胶电泳可准确检出HbA2和HbF区带,对HbH、HbBart's区带的检测能力不足。当HbA2降低、异丙醇试验阳性、红细胞脆性试验(一管法)阳性时需用醋酸纤维素薄膜电泳进行检测并定量测定HbH、Hb Bart's值。在筛查和普查地中海贫血时可使用电泳方法,但在临床确诊和产前诊断时必须采用基因分析。

关键词: 血红蛋白; 琼脂糖凝胶电泳; 醋酸纤维素薄膜电泳; 地中海贫血
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)03-229-04
Comparison on the consistency of two electrophoresis methods in the detection of hemoglobin
CHEN Yongxiu1, ZHOU Yunzhen2, CHEN Jinhong3, LI Shuquan4, LONG Guifang4
1.Department of Clinical Laboratory,Hengxian People's Hospital,Guangxi Hengxian 530300,China
2. Department of Obstetrics,Hengxian People's Hospital,Guangxi Hengxian 530300,China
3. Department of Hematology,Hengxian People's Hospital,Guangxi Hengxian 530300,China
4.Hemoglobin Laboratory,the First Affiliated Hospital,Guangxi Medical University,Guangxi Nanning 530021, China
Abstract
Objective

To compare the results'consistency of agarose gel electrophoresis and cellulose acetate membrane electrophoresis in the detection of hemoglobin.

Methods

By Sebia Hydrasys LC automated agarose gel electrophoresis and cellulose acetate membrance electrophoresis, the hemoglobin levels of 4 126 patients with Mediterranean anaemia were detected(pH value = 8.6). The HbA2, HbH,and HbBart's contents were determined by spectrophotometry. The HbF content was determined by alkaline denaturation test. The results of the 2 methods were compared. The cases with different results by the 2 methods were confirmed by genetic analysis.

Results

A total of 4 126 cases by agarose gel electrophoresis had 686 cases of beta-Mediterranean anaemia (HbA2 and/or HbF increasing)and 321 cases of alpha-Mediterranean anaemia(HbA2 decreasing). Cellulose acetate membrane electrophoresis had 683 cases of beta-Mediterranean anaemia and 323 cases of alpha-Mediterranean anaemia. Basically, the results were consistent for HbA2 and HbF by the 2 methods. Agarose gel electrophoresis detected 103 cases of HbH, 71 cases of HbBart's and 63 cases of HbCS. Cellulose acetate membrane electrophoresis detected 141 cases of HbH, 101 cases of HbBart's and 65 cases of HbCS. After being confirmed by genetic analysis, agarose gel electrophoresis missed 38 cases of HbH, 30 cases of HbBart's and 2 cases of HbCS.

Conclusions

Agarose gel electrophoresis can accurately detect HbA2 and HbF,and it has deficiencies for HbH and HbBart's. While HbA2 decreasing, isopropyl alcohol-test positive and erythrocyte fragility test (one tube method) positive, cellulose acetate membrane electrophoresis should be used to the quantitive determination of HbH and HbBart's. Electrophoresis can be used in the screening and general investigation of Mediterranean anaemina, and genetic analysis should be used in clinical confirmation and antepartum diagnosis.

Keyword: Hemoglobin; Agarose gel electrophoresis; Cellulose acetate membrane electrophoresis; Mediterranean anaemia
引言

地中海贫血是一类以珠蛋白α链或β链合成不足或缺失为特征的隐性遗传性疾病。最常见为α-地中海贫血和β-地中海贫血,我国以南方地区多见,如广西、广东,四川、云南等地。开展地中海贫血检测是临床上诊断贫血必不可少的项目。目前很多基层医院采用Sebia Hydrasys LC琼脂糖凝胶电泳系统(简称琼脂糖凝胶电泳)替代醋酸纤维素薄膜电泳对地中海贫血进行筛查。为比较2种电泳方法的一致性,我们进行了相关实验。

材料和方法
一、一般资料

4 126例临床标本来自2009年5月至2011年5月期间横县人民医院门诊和住院患者及其他体检人员。男1 862例,女2 264例,年龄5个月~75岁。

二、仪器与试剂

1. 琼脂糖凝胶电泳 法国Sebia公司生产的Sebia Hydrasys LC全自动琼脂糖凝胶电泳系统及其配套的HYRYS扫描系统,Hb琼脂糖凝胶试剂、缓冲条、染色剂、红细胞溶解液由法国SEBIA公司配套提供。脱色液(0.1%冰醋酸)自配。

2. 醋酸纤维素薄膜电泳 北京市六一仪器厂生产的DYY-2C型电泳仪及电泳槽,山东高密医仪器公司生产的半自动生化仪,自配的试剂(包括浸醋酸纤维素薄膜Tris缓冲液、硼酸缓冲液、丽春红染色液、3%醋酸溶液,抗碱血红蛋白测定用酸性半饱和硫酸铵溶液、NaOH溶液。)及具体操作按《全国临床检验操作规程》(第3版)[ 1]进行。

三、方法

1.琼脂糖凝胶电泳 按仪器操作说明书进行,将已用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝的静脉血用生理盐水反复洗涤3次处理,吸取10 μL压积红细胞进行溶解,按说明书进行操作,电泳、染色烘干后用HYRYS扫描系统扫描电泳胶片,对各条区带进行定量分析。

2.醋酸纤维素薄膜电泳 按《全国临床检验操作规程》(第3版)[ 1]采用醋酸纤维素薄膜电泳检测HbA、HbA2、 HbH 、HbBart's、HbCS。将已用EDTA-K2抗凝的静脉血用生理盐水反复洗涤3次处理,用蒸馏水制成溶血液点样电泳,微量醋酸纤维薄膜电泳观察区带。

3.HbF含量测定 用碱变性试验测定HbF含量。按《全国临床检验操作规程》(第3版)[ 1]进行。

4.其他试验 H包涵体试验、异丙醇试验、红细胞脆性试验(一管法)、血常规检查。2种电泳方法检测不一致的样本送广西医科大学第一附属医院血红蛋白研究室进行基因分析确诊。

四、统计学方法

两样本率比较用 χ2检验。

结果
一、 2种电泳方法在β-地中海贫血筛查中的比较

4 126例样本中琼脂糖凝胶电泳共检出β-地中海贫血686例,检出率为16.63%,其中单HbA2增高574例、单HbF增高47例、HbA2+HbF同时增高65例。醋酸纤维素薄膜电泳检出β-地中海贫血683例,检出率为16.55%,其中单HbA2增高572例、单HbF增高49例、HbA2+HbF同时增高62例。对琼脂糖凝胶电泳检测出HbF增高(>3%)的样本采用碱变性试验进行复检,二者结果基本一致。2种电泳方法对HbA2和HbF增高的检出情况见 表1、 表2。

表1 2种电泳方法对HbA2升高的检测一致性比较(例)
表2 2种电泳方法对HbF升高的检测一致性比较(例)
二、2种电泳方法在α-地中海贫血筛查中的比较

4 126例样本中琼脂糖凝胶电泳系统共检出α-地中海贫血(HbA2降低)321例,检出率为7.78 %;醋酸纤维素薄膜电泳检出α-地中海贫血(HbA2降低)323例,检出率为7.82%。2种电泳方法对HbA2降低的检出情况见 表3。

表3 2种电泳方法对HbA2降低的检测一致性比较(例)
三、2种电泳方法对HbH、HbBart's、HbCS区带检出率的比较。

2种电泳方法对HbH、HbBart's、HbCS区带的检出情况见 表4、 表5、 表6。琼脂糖凝胶电泳对HbH、HbBart's和HbCS区带的检出率分别为2.50%、1.72%和1.52%;醋酸纤维素薄膜电泳分别为3.42%、2.45%和1.58%。经基因分析确诊,琼脂糖凝胶电泳漏检HbH 38例、HbBart's 30例、HbCS 2例。2种方法对HbH和HbBart's区带的检出率差异有统计学意义( P<0.05),对HbCS区带的检出率差异无统计学意义( P>0.05)。

表4 2种电泳方法检出HbH区带的一致性比较(例)
表5 2种电泳方法检出HbBart's区带的一致性比较(例)
表6 2种电泳方法对HbH、Hb Bart's、HbCS区带的检测率比较[例(%)]

观察琼脂糖凝胶电泳漏检的38例HbH、30例HbBart's 区带图谱可发现HbA2区带大多淡染、HbH及HbBart's 区带呈淡蓝色,散在云雾状,而醋酸纤维素薄膜电泳区带清淅。38例琼脂糖凝胶电泳漏检的HbH病经送广西医科大学第一附属医院血红蛋白研究室进行基因分析确诊,全部为缺3个α基因中间型α地中海贫血HbH病。见 表7。其中6例2种方法的区带图谱见 图1。

表7 2种方法检测不一致的38例HbH病样本基因分析结果

注:(a)~(f)为电泳图谱,上方为琼脂糖凝胶电泳图谱,下方为用醋酸纤维素薄膜电泳检出的琼脂糖凝胶电泳漏检的相应膜带;(e)图中下方第2条膜带为正常对照带;(f)图中下方是第1泳道和11泳道膜带;(a)图中的第2泳道、(b)图中的第4泳道、(c)图中的第11泳道、(d)图中的第11泳道、(e)图中的第5泳道、(f)图中的第11泳道均为全自动琼脂糖凝胶电泳漏检的HbH区带与Hb Bart's区带;(f)图中的第1泳道为检出的HbH区带与Hb Bart's区带

'>		图1 全自动琼脂糖凝胶电泳漏检的部分HbH区带与HbBart's区带图谱注:(a)~(f)为电泳图谱,上方为琼脂糖凝胶电泳图谱,下方为用醋酸纤维素薄膜电泳检出的琼脂糖凝胶电泳漏检的相应膜带;(e)图中下方第2条膜带为正常对照带;(f)图中下方是第1泳道和11泳道膜带;(a)图中的第2泳道、(b)图中的第4泳道、(c)图中的第11泳道、(d)图中的第11泳道、(e)图中的第5泳道、(f)图中的第11泳道均为全自动琼脂糖凝胶电泳漏检的HbH区带与Hb Bart's区带;(f)图中的第1泳道为检出的HbH区带与Hb Bart's区带

三、其他试验结果

4 126例样本中H包涵体试验阳性149例、异丙醇试验阳性273例、红细胞脆性试验(一管法)阳性1 206例、红细胞平均体积(MCV)≤80 fL且平均红细胞血红蛋白含量(MCH)≤25.0 pg 3 672例。

讨论

琼脂糖凝胶电泳法是根据不同Hb分子所带电荷不同,在电场中迁移率不同而达到分离Hb不同成份目的。经染色、脱色、固定,在一定波长下可扫描定量出各组分的百分比。在碱性pH值条件下,用琼脂凝胶为载体,可分离出正常的Hb中的HbA、HbA2、HbF等成份[ 2]。琼脂糖凝胶电泳较醋酸纤维素薄膜电泳分辨力强、区带整齐、吸附小[ 3],且在全自动扫描仪上扫描定量,可避免人工操作带来技术上的误差,保证血红蛋白电泳各区带定量的准确性[ 4]。醋酸纤维素薄膜电泳对HbF的分辨有一定的限制,所以电泳的同时需要用HbF碱变性试验测定HbF含量,步骤比较繁琐。使用法国Sebia-Hydrasys LC全自动琼脂糖凝胶电泳系统,当HbF>3%时HbA区带与HbF区带分离得较开,扫描HbF定量比较方便、准确,既能直接用肉眼观察HbA2是否增高,又可扫描HbA2含量;能严格控制试验条件,减少人为误差,结果准确。HbF增高的病例也可直接扫描HbF含量,从而代替HbF碱变性试验[ 5]。琼脂糖凝胶电泳能准确分离各种区带,图谱可永久保存[ 6];而醋酸纤维素薄膜较脆,容易破碎,区带颜色容易脱,不易保存。

然而,对于HbH和HbBart's区带,醋酸纤维素薄膜电泳的分离能力强于琼脂糖凝胶电泳,可清淅地分离出HbH区带与HbBart's区带。本研究结果显示琼脂糖凝胶电泳检出的103例HbH及71例HbBart's区带用醋酸纤维素薄膜电泳全部检测出来,并多检出了38例HbH及30例HbBart's区带。38例HbH病经广西医科大学第一附属医院血红蛋白研究室进行基因分析确诊,全部为缺3个α基因中间型α地中海贫血HbH病。琼脂糖凝胶电泳未检出HbH及HbBart's区带的原因可能是HbH及HbBart's是一种不稳定的血红蛋白,很容易受外界因素的影响如温度、电压及缓冲液等破坏,使其无法分离或分离不清,染色后出现HbH及HbBart's区带淡染,区带分离不清就会导致扫描不出HbH、HbBart's区带,造成漏诊。在2种电泳方法检出的141例α-地中海贫血中,发现了以下的情况:(1)HbA2区带定量降低;(2)红细胞脆性试验阳性;(3)异丙醇试验阳性;(4)血常规检测中Hb含量降低、MCV、MCH降低;(5)观察琼脂糖凝胶电泳漏检的38例HbH、30例HbBart's的图谱区带,发现HbH及HbBart's 区带呈淡蓝色,散在云雾状。目前很多基层医院使用琼脂糖凝胶电泳筛查地中海贫血,认为醋酸纤维素薄膜电泳使用不便,不用醋酸纤维素薄膜电泳进行复检。因此建议在使用琼脂糖凝胶电泳筛查地中海贫血时,如发现上述现象应采用醋酸纤素维薄膜电泳复检,比色定量测定HbH及HbBart's区带,以免漏检。

总之,琼脂糖凝胶电泳筛查地中海贫血具有简便、快捷、多数区带定量准确等优点,但对部分HbH及HbBart's 区带却不能准确检出,应注意结合其他实验阳性现象以避免漏检HbH病。另外,电泳方法只能检测出HbH中间型及部分轻型地中海贫血,而有些轻型地中海贫血检测不出,因而必须配合其他实验室检查及做家系调查。在群体筛查和普查地中海贫血时可以使用血红蛋白电泳方法,但在临床确诊和产前诊断时必须做地中海贫血基因分析。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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