ELISA一步法和二步法检测临界值范围HBsAg的性能比较
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仲腊春. ELISA一步法和二步法检测临界值范围HBsAg的性能比较. 28(12): 1149-1151[] 
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ELISA一步法和二步法检测临界值范围HBsAg的性能比较
仲腊春,女,1970年生,学士,副主任技师,主要从事临床生物化学和免疫学检验工作。
摘要
目的
比较酶联免疫吸附试验(ELISA)一步法和二步法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的性能。
方法将二步法初检吸光度(
HBsAg检测结果
二步法测定HBsAg与一步法比较,敏感性高。一步法存在漏检,二步法在检测低水平和过高浓度的HBsAg标本中具有显著优势。
关键词:
酶联免疫吸附试验; 一步法; 二步法; 乙型肝炎表面抗原
中图分类号:R446.61
文献标志码:A
文章编号:1673-8640(2013)12-1149-03
Keyword:
引言
乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)是乙型病毒性肝炎的重要血清学标志物。HBsAg检测的准确性,尤其是低水平表达的、处于临界值附近(灰区)的标本的HBsAg检测的准确性,对乙型病毒性肝炎的早诊断、早治疗具有十分重要的意义。根据2010年版《中华人民共和国药典》[ 1],本实验室从2011年3月开始用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)二步法测定HBsAg。为了评价一步法和二步法检测HBsAg的性能,本研究对2种方法检测HBsAg临界值范围的标本结果做了分析比较。
材料和方法
一、测试标本
2012年8月1日至2013年5月16日期间用二步法ELISA测定HBsAg吸光度( A)值>0.7×Cut-off值(即0.073 5)的1 339例标本。
二、仪器和试剂
科华KHB ST -360酶标仪;科华KHB ST -36W洗板机;罗氏e 411电化学发光仪。
上海荣盛生物药业有限公司ELISA HBsAg诊断试剂盒(一步法批准文号:国药准字S10950045;二步法批准文号 :国药准字S10950045),结果判断(Cut-off值) A值≥0.105为阳性,<0.105为阴性;北京康彻思坦生物HBsAg(2 IU/mL);10%小牛血清稀释液;罗氏配套HBsAg定量试剂,结果判断:Cut-off指数(COI)≥1.0有反应性为阳性,<1.0无反应性为阴性。
三、方法
ELISA一步法测定HBsAg是将标本和酶标抗体一起加入包被孔后37 ℃温育30 min,二步法是将标本加入包被孔后即温育60 min,然后加酶标抗体再温育30 min,后续显色和终止步骤两法相同。每天将阴性、阳性对照及将2 IU/mL标准物质稀释5倍和10倍各两孔随患者标本在同样条件下测定,洗板机洗板,酶标仪读数。将前一日二步法 A值>0.073 5的患者标本次日再用一步法测定;将HBsAg结果临界值范围定为(0.7×Cut-off值)~(5×Cut-off值),即 A值在0.073 5~0.525 0之间。凡用二步法检测 A值在此范围的标本均用二步法复测,将所有复检范围内的标本用电化学发光方法检测作为一步法与二步法检测结果的评价标准[ 2] 。
四、统计学方法
采用SPSS PASW Statistics 18.0统计软件,用配对 χ2比较一步法与二步法检测HBsAg的性能, P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、一步法和二步法ELISA检测HBsAg结果比较
2种方法检测HBsAg对于 A值>0.525 0和 A值<0.073 5的标本结果一致性高, A值>0.525 0的二步法1 232例,一步法1 192例,符合率为96.8%;而二步法复检后24例 A值<0.073 5的标本一步法均<0.073 5,另有一步法 A值<0.073 5的4例标本二步法复检后 A值>0.073 5,2种方法符合率为82.8%;在0.073 5< A值<0.525 0范围内,2种方法的符合率为65.1%。见表1:
 | 表1 ELISA一步法和二步法检测HBsAg初复检结果 |
二、 一步法和二步法检测HBsAg结果低符合率范围的标本用电化学发光法测定结果
以电化学发光法测定结果为参考标准,分析2种方法对于低水平表达的、处于灰区内的标本的检测能力。结果电化学发光法阴性的28例,一步法和二步法均为阴性,2种方法特异性均为100.0%,而79例电化学发光法结果阳性的标本一步法和二步法结果阳性例数分别为60例和77例,敏感性分别为75.9%、97.5% ,二步法敏感性明显高于一步法( P<0.05)。ELISA一步法对低水平HBsAg的漏检率高达31.7%,而二步法仅为2.5%,一步法存在明显漏检。将初检 A值较低的标本进行复检是非常必要的,84例二步法初检 A值0.105 0~0.525 0之间的标本复检后只有77例 A值>0.105 0(ELISA判为阳性);另 A值<0.105 0的7例电化学发光法结果均为COI<1.0(阴性)。
三、HOOK效应对一步法和二步法的影响
在1 339例标本中有5例二步法 A值>2.500 0,而一步法检测 A值分别为0.097 0、0.102 0、0.184 0、0.267 0和0.303 0。将这5例标本稀释100倍后一步法 A值均>2.500 0,这是标本中过高浓度HBsAg所致的HOOK效应,是双抗体夹心ELISA一步法检测抗原的先天不足,由此所致的漏检率为0.38%(5/1 311)。
讨论
在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染的窗口期、急性期、恢复期,血清中HBsAg含量会很低,一般认为HBsAg 含量0.1 ng/mL即具传染性,部分滴度低的HBsAg阳性仍存在HBV复制,若患者免疫功能受损,肝脏病情会加重,所以HBsAg的准确检测非常重要,对于低水平表达的、处于灰区范围内一般为(1±20%Cut-off值)HBsAg使用一步法存在漏检,二步法的敏感性明显高于一步法,结合标准物质其最低检测限可达0.1~0.2 IU/mL[ 3]。与一步法比较,二步法敏感性提高可能是因为标本中抗原在加酶标抗体之前已在温育条件下充分与包被抗体反应了60 min,对于 A值>0.525 0的标本影响不大,但对于低水平HBsAg标本就有了适宜的温度和足够的时间进行抗原抗体反应。
双抗体夹心ELISA一步法检测HBsAg,在单克隆乙型肝炎表面抗体(抗HBs)包被反应孔中同时加入待测标本和酶标抗HBs,若待测抗原浓度过高,过量的被测物(HBsAg)分别与固相抗-HBs、酶标记抗HBs竞争结合,难以或不能有效地形成夹心结合物,固相抗体-待测抗原-酶标抗体形成反而减少,于是反应显色降低或不显色而形成 HOOK效应。而在二步法检测中,高浓度的被测物(HBsAg)只能与包被的固相抗HBs“饱和”性结合,形成抗原-抗体复合物,多余游离的HBsAg在第1次洗涤时被去除,随后加入的酶标记抗体与抗原-抗体复合物结合,形成结构较完整难以溶解的抗HBs-HBsAg-酶标记抗HBs免疫复合物[ 4]。所以,二步法避免了一步法所致的HOOK效应。
ELISA检测HBsAg除受被测物含量较低和过高影响外,还受一些非特异性因素干扰,内源性的如类风湿因子、高浓度的非特异性免疫球蛋白、嗜异性抗体、某些自身抗体等;外源性的如标本溶血、凝固不全、检测过程中的操作误差尤其是洗板等,这些因素都可致结果假阴性或假阳性。因此,确定ELISA检测HBsAg合适的复检范围,对处于临界值附近的结果坚持复检,必要时用化学发光免疫分析法等方法做定量测定,结合HBV感染其他血清标志物的检测结果综合分析,以尽可能降低假阳性率和假阴性率,及时与临床医生沟通,定期随访复查,是提高检测结果可靠性的有效措施。
The authors have declared that no competing interests exist.
参考文献
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