引用本文
刘君, 胡嘉波, 裴豪, 蒯守刚, 陈丽艳. 三磷酸腺苷发光法在耐多药结核分枝杆菌诊断中的运用. 28(12): 1121-1123[LIU Jun, HU Jiabo, PEI Hao, KUAI Shougang, CHEN Liyan. The application of adenosine triphosphate bioluminescence assay in the diagnosis of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosis . 上海检验医学, 28(12): 1121-1123]  
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三磷酸腺苷发光法在耐多药结核分枝杆菌诊断中的运用
刘君1, 胡嘉波1, 裴豪2, 蒯守刚2, 陈丽艳3
1.江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏 镇江 212013
2.无锡市第五人民医院, 江苏 无锡 214005
3.无锡市河埒街道卫生服务中心,江苏 无锡 214072

刘君,男,1985年生,硕士,技师,主要从事结核分枝杆菌的快速诊断研究。

胡嘉波,联系电话:0511-85038449。

基金:无锡市科技局社会发展项目(CSE01N1117);
摘要
目的

通过与罗氏固体培养法比较,评估三磷酸腺苷发光法检测耐多药结核分枝杆菌的可行性。

方法

采用三磷酸腺苷发光法与罗氏固体培养法同时检测和分析149例临床分离的结核分枝杆菌。

结果

三磷酸腺苷发光法与罗氏固体培养法的一致率为92.6%(138/149),差异无统计学意义(χ2=0.57,P=0.45)。三磷酸腺苷发光法检测时间为(6.6±2.1) d,明显快于传统罗氏固体培养法的28 d(t=422.7,P<0.001)。

结论

与常规检测方法比较,三磷酸腺苷发光法具有快速、简便、准确性高等优点,对耐多药结核患者的早期诊断和耐药结核分枝杆菌流行的控制有很大帮助,适合实验室开展。

关键词: 三磷酸腺苷发光法; 药物敏感性检测; 耐多药结核分枝杆菌
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)12-1121-03
The application of adenosine triphosphate bioluminescence assay in the diagnosis of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosis
LIU Jun1, HU Jiabo1, PEI Hao2, KUAI Shougang2, CHEN Liyan3
1.InstituteofBasicMedicineandMedicalTechnology,JiangsuUniversity,JiangsuZhenjiang 212013,China
2.WuxiFifthPeople'sHospital,JiangsuWuxi 214005,China
3.WuxiHelieCommunityHealthServiceCenter,JiangsuWuxi 214072,China
Abstract
Objective

To compare with Roche solid culture method, and to evaluate the feasibility of adenosine triphosphate bioluminescence assay for detecting multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosis.

Methods

By Roche solid culture method and adenosine triphosphate bioluminescence assay, 149 clinical isolates ofMycobacteriumtuber-culosis were determined and analyzed.

Results

The coincidence rate of adenosine triphosphate bioluminescence assay with Roche solid culture method was 92.6% (138/149), and the difference had no statistical significance (χ2=0.57,P=0.45). The detection time of adenosine triphosphate bioluminescence assay was (6.6±2.1) d, which was faster than that of Roche solid culture method (28 d,t=422.7,P<0.001).

Conclusions

Compared with the conventional detection methods, adenosine triphosphate bioluminescence assay is simple, rapid and accurate. It is helpful for detecting multidrug-resistant tuberculosis patients and controlling the prevalence ofMycobacteriumtuberculosis. It is suitable for clinical laboratory.

Keyword: Adenosine triphosphate bioluminescence assay; Drug sensitivity test; Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis
引言

目前,耐药结核的流行已经成为全球公共卫生体系的重大问题,耐药结核的产生不仅降低患者的治愈率还大大增加了治疗的费用[ 1, 2, 3]。保守估计每年新发生的结核患者中有5%已属于耐多药结核患者,其中中国的患者人数在世界排名第2,仅次于印度。由于诊断方法的落后和迟缓使耐多药结核的控制变得复杂而困难[ 4, 5]。快速、简便且准确、可靠的药物敏感性检测技术变得越来越重要[ 6]。我们用三磷酸腺苷发光法作为耐多药结核分枝杆菌的诊断技术,并比较和分析其结果与实验室广泛运用的罗氏药物敏感性技术的差异,以供临床参考。

材料和方法
一、试验菌株

149株结核分枝杆菌来自无锡市第五人民医院2011年1月至2012年9月培养阳性的临床标本。标准人型分枝杆菌(H37Rv)来源于江苏省疾病预防控制中心。

二、方法

1.仪器与试剂

测定三磷酸腺苷生物发光所用HygienaPI-102仪器、裂解液及荧光素酶、三磷酸腺苷发光检测管由无锡市海规生物科技有限公司提供。分枝杆菌药物敏感性罗氏培养管购自珠海贝索生物技术有限公司。Airstream® AⅡ型二级生物安全柜购自新加坡ESCO公司。XW-80旋涡混合器购自上海医科大学仪器厂。LRHS-250-Ⅱ恒温恒湿培养箱购自上海跃进医疗器械有限公司。异烟肼、利福平购自Sigma公司。

2.菌悬液的制备

用接种环刮取适量L-J培养基斜面对数生长期的菌落于无菌磨菌瓶,加入1~2滴0.5%吐温-80溶液和玻璃珠,用旋涡混合器振荡后加入0.85% NaCl制备成菌悬液,静止约10 min,待大颗粒菌团沉降后取上清液,用比浊仪调至1麦氏浊度菌悬液。用无菌生理盐水将1麦氏浊度菌悬液稀释为1∶100的菌液浓度备用。

3.罗氏固体培养法

分枝杆菌药物敏感性测定按照《临床技术操作规范》操作[ 7]。

4.三磷酸腺苷发光法药物敏感性试验

在培养管中加入浓度为0.1 μg/mL异烟肼或1 μg/mL利福平溶液、7H9培养肉汤和1∶100稀释的菌悬液0.5 mL,生长对照管加入7H9培养肉汤和1∶100稀释的菌悬液0.5 mL。分别从鉴定管和生长对照管中取100 μL溶液加入裂解液及荧光素酶,用HygienaPI-102检测初始三磷酸腺苷读数,将培养管放入恒温恒湿培养箱培养并检测其3、5和7 d时鉴定管和生长对照管的三磷酸腺苷读数。鉴定管中的三磷酸腺苷读数变化大于初始读数2倍以上表示耐药,小于2倍则是敏感。

三、统计学方法

利用SPSS18.0软件进行统计分析,采用配对 t检验和 χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、标准菌株(H37Rv)的最小抑菌浓度

运用三磷酸腺苷发光法检测在异烟肼药物浓度为0、0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.4 μg/mL的培养管中标准菌株的生长情况,发现除了在异烟肼浓度为0和0.01 μg/mL的培养管中有菌株生长外,其余培养管均无菌生长。

运用三磷酸腺苷发光法检测在利福平药物浓度为0、0.5、1、2、4、8、16 μg/mL的培养管中标准菌株的生长情况,发现除了在利福平浓度为0和0.5 μg/mL的培养管中有菌株生长外,其余培养管均无菌生长。

根据以上结果,本研究分别选择0.1和1 μg/mL作为三磷酸腺苷发光法检测异烟肼和利福平耐药的检测浓度。

二、三磷酸腺苷发光法和罗氏固体培养法检测结果的比较

在149株结核分枝杆菌中,三磷酸腺苷发光法检出耐多药菌株42株,罗氏固体培养法药物敏感性试验检出耐多药菌株48株,两者的一致性为92.6%(138/149),差异无统计学意义( χ2=0.57, P=0.45)。结果不一致的11例标本中,异烟肼结果不符的有9例,异烟肼耐药结果的一致性为94.0%(140/149);利福平结果不符的有6株,利福平结果的一致性为96.0%(143/149)。见表1:

表1 2种方法检测结果的比较
三、三磷酸腺苷发光法和罗氏固体培养法检测时间的比较

149例检测结果中,三磷酸腺苷发光法平均检测时间为(6.6±2.1)d,罗氏固体培养法的检测时间为28 d,两者差异有统计学意义( t=422.7, P<0.001)。

讨论

结核病是全世界危害人类健康的重要病症之一,在2010年大约有145万患者死于结核病。随着耐多药和泛耐药结核菌的不断出现,结核病的控制和预防工作变得更加严峻[ 8, 9]。有研究表明,结核耐药患者的增加大部分原因是由于耐药携带者长期排菌所引起的传播,如在西班牙人类免疫缺陷综合征/结核分枝杆菌共感染的患者中有52.6%耐多药结核病由近期传播引起[ 10],在匈牙利为75%[ 11],而在突尼斯高达90%[ 12]。中国虽然无此类报道,但是其耐多药的发生率高于全球平均水平近2倍[ 13],如此庞大的耐多药人群必将对人们的健康产生巨大的影响,如何有效地诊断和控制耐多药结核患者已经成为当前重要的健康问题[ 14, 15]。因此一种快速、简便且适合开展的结核分枝杆菌检测技术显得尤为重要[ 16]。

目前,罗氏固体培养法在实验室已经广泛运用,结果准确、可靠且价格低廉,但是28 d的检测时间大大延长了耐药和耐多药患者的发现时间,使其成为疾病治疗和控制环节上的一大缺陷。所有微生物体内都含有一定量的三磷酸腺苷,三磷酸腺苷与荧光素酶混合后能产生荧光,并且产生荧光的强度与三磷酸腺苷的含量呈正比[ 17]。三磷酸腺苷发光法是在传统罗氏固体培养法药物敏感性的原理上融入了这一特点,在含药培养管中如果有菌生长,则其三磷酸腺苷的含量将会越来越高;反之不生长,其三磷酸腺苷的含量则下降。此方法的平均检测时间为(6.6±2.1)d,比罗氏固体培养法缩短了很多,有效地提高了耐多药患者发现的效率。本研究还发现三磷酸腺苷发光法有着较高的准确性,与传统罗氏固体培养法检出耐多药菌株的一致率高达92.6%;单个药物比较的一致性更高,异烟肼耐药结果的一致率为94.0%,利福平耐药结果的一致率为96.0%。因此,三磷酸腺苷发光法在保证结果准确、可靠的同时大幅提高了检测的速度,更快地为临床治疗方案的变更提供可靠依据,使耐多药患者的管理和控制变得更方便、快捷。

结核分枝杆菌快速、正确的药物敏感性检测技术是耐多药患者早期发现的可靠保证,也为提高耐多药患者治愈率和减少耐药结核流行起到一定作用。常规的结核分枝杆菌的体外药物敏感性检测方法如固体培养法所需时间较长,急需开发出快速、准确的体外药物敏感性方法。三磷酸腺苷发光法应用于结核分枝杆菌耐药检测有一定的可行性和科学性,值得推广。

The authors have declared that no competing interests exist.

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