引用本文
郑齐锶, 曹小利, 周爱平, 张之烽, 沈翰, 张葵. 尿路感染大肠埃希菌耐药特点与种系分型和遗传相关性分析. 28(12): 1102-1105[ZHENG Qisi, CAO Xiaoli, ZHOU Aiping, ZHANG Zhifeng, SHEN Han, ZHANG Kui. Analysis on the resistant characterization, phylogenetic grouping and genetic relatedness ofEscherichiacoli in urinary tract infection . 上海检验医学, 28(12): 1102-1105]  
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尿路感染大肠埃希菌耐药特点与种系分型和遗传相关性分析
郑齐锶1, 曹小利1, 周爱平2, 张之烽1, 沈翰1, 张葵1
1. 南京大学附属鼓楼医院检验科, 江苏 南京 210008
2. 南京大学附属鼓楼医院医务处, 江苏 南京 210008

郑齐锶,男,1988年生,学士,技师,主要从事临床微生物检验工作。

张葵,联系电话:025-83105555-60666。

基金:南京市医学科技发展资金资助项目(LE318);
摘要
目的

分析尿路感染大肠埃希菌的耐药特点、种系分型和遗传相关性,并对比其在医院和社区感染中的差异。

方法

对2010年非重复分离185株尿路感染大肠埃希菌进行敏感性测定、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)筛查、种系分型、同源性及统计学分析。

结果

细菌对多种药物的耐药率>49.0%。185株细菌均有很大的遗传多样性,产酶率为78.4%。D型大肠埃希菌最为常见(49.7%),其ESBLs的产生率与头孢噻肟等的耐药性相关(P<0.05)。上述各因子在医院和社区感染菌株中差异无统计学意义(P>0.05)。

结论

本研究尿路感染主要由D型大肠埃希菌引起,这些细菌呈遗传多样性,高产ESBLs,对多种抗菌药物耐药。

关键词: 大肠埃希菌; 尿路感染; 种系分型; 遗传相关性
中图分类号:R378.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)12-1102-04
Analysis on the resistant characterization, phylogenetic grouping and genetic relatedness ofEscherichiacoli in urinary tract infection
ZHENG Qisi1, CAO Xiaoli1, ZHOU Aiping2, ZHANG Zhifeng1, SHEN Han1, ZHANG Kui1
1.DepartmentofClinicalLaboratory,DrumTowerHospital,NanjingUniversity,JiangsuNanjing 210008,China
2.DepartmentofMedicalService,DrumTowerHospital,NanjingUniversity,JiangsuNanjing 210008,China
Abstract
Objective

To analyze the resistant characterization,phylogenetic grouping and genetic relatedness ofEscherichiacoli in urinary tract infection, and compare the differences of these factors among the hospital and community infections.

Methods

A total of 185 non-duplicateEscherichiacoli in urinary tract infection were analyzed for sensitivities, extended spectrum beta-lactamases (ESBLs) screening, phylogenetic grouping and genetic relatedness, and the results were analyzed statistically.

Results

The resistance rates to multiple antibiotics were>49.0%. A total of 185 isolates displayed a high diversity, and the prevalence of ESBLs was 78.4%. Phylogroup DEscherichiacoli was the most frequent(49.7%), and the correlation between the production rate of ESBLs and resistance to cefotaxime was observed (P<0.05). Additionally, there was no statistical significant on the distribution of the factors between the hospital and community infections (P>0.05).

Conclusions

Urinary tract infection is mainly caused by the phylogroup DEscherichiacoli which displays a high diversity of genetic relatedness. High-produced ESBLs are multiple resistant to antibiotics.

Keyword: Escherichia coli; Urinary tract infection; Phylogenetic grouping; Genetic relatedness
引言

尿路感染是指病原体侵犯尿路黏膜或组织引起的尿道炎症,是临床上一种常见的感染病。病原菌以大肠埃希菌为主[ 1]。近年来,随着抗菌药物的广泛使用,产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases, ESBLs)不断增多,大肠埃希菌的耐药率也在不断升高[ 2, 3]。本研究旨在分析鼓楼医院2010年临床非重复分离尿路感染大肠埃希菌对常用抗菌药物的耐药率、产ESBLs情况以及种系分型和遗传相关性,并对比ESBLs、耐药率、种系分型等在医院和社区获得性感染大肠埃希菌中的差异。

材料和方法
一、 材料

1. 菌株

收集鼓楼医院2010年连续非重复分离大肠埃希菌185株,所有样本均为尿路感染患者的中段尿。依据有关规定,将住院患者入院48 h之后分离的大肠埃希菌归类为医院感染菌,而将住院患者入院后48 h内分离的细菌及门诊和急诊患者收集的细菌归类为社区感染菌,本研究的185株大肠埃希菌中,94株为医院获得性尿路感染致病菌,91株为社区获得性感染病原菌。质控菌株为大肠埃希菌(ATCC 25922)。所有菌株于-70 ℃冰箱保存。

2. 主要仪器

聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增仪,Eppendorf 台式高速离心机, 电泳仪,细菌培养箱。

3. 培养基和药物敏感性纸片

采用法国生物梅里埃公司生产的ATB微生物半自动分析仪和肠杆菌科细菌鉴定试剂盒(API20E)进行菌株鉴定。药物敏感性纸片为英国Oxoid公司产品。

二、方法

1. 药物敏感性试验 药物敏感性试验采用纸片扩散法,药物敏感性结果按美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)2012年标准进行判读。ESBLs检测均按CLSI推荐的双纸片扩散法进行确证。

2. 种系分型 多重PCR检测 chuA、 yjaA和 tspe4基因[ 4],使用引物序列见表1:

表1 种系进化关系分型引物序列及产物大小

反应条件为:95 ℃ 15 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 90 s,72 ℃ 60 s,72 ℃ 10 min,30个循环。阳性对照为大肠埃希菌ECOR 20 ( yjaA阳性), ECOR 48 ( chuA阳性), ECOR 58 ( tspe4 .c2阳性)和ECOR 62( chuA、 yjaA和 tspe4 .c2阳性),阴性对照为大肠埃希菌 ECOR 4。分型的依据为:A型, yjaA阳性;B1型, tspe4 .c2阳性;B2型, chuA和 yjaA阳性或 chuA、 yjaA和 tspe4 .c2阳性;D型, chuA阳性或 chuA和 tspe4 .c2阳性;NT, yjaA、 chuA和 tspe4 .c2阴性。

3. 同源性分析

采用非重复基因扩增技术(repetive extragenic palindromic PCR,REP-PCR)对185株细菌进行同源性分析[ 5]。 使用2×Taq PCR MasterMix (Tiangen KT201-01)配置25 mL的反应体系,得到的产物与 trans2K plus DNA maker一起在1.5%琼脂糖凝胶中120 V的电压下跑胶2 h 。结果使用Biomunerics软件分析。

三、统计学方法

使用WHONET 5.4软件对细菌的耐药情况进行分析。使用SPSS 19.0软件分析各型大肠埃希菌与抗菌药物耐药及产ESBLs之间的相关性。 χ2检验分析耐药性、种系分型和产ESBLs在医院和社区获得性感染菌种的差异。 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、细菌耐药性结果

细菌对抗菌药物的耐药性依次为:氨苄西林-舒巴坦92.4%、阿米卡星32.4%、头孢他啶24.9%、头孢噻肟66.5%、头孢哌酮-舒巴坦4.9%、亚胺培南14.6%、哌拉西林-他唑巴坦43.2%、哌拉西林49.7%、头孢吡肟49.7%、替卡西林-克拉维酸50.8%、左氧氟沙星62.2%、氨曲南47.0%。其中D型大肠埃希菌对氨苄西林-舒巴坦、头孢噻肟、左氧氟沙星、哌拉西林-他唑巴坦、哌拉西林、头孢吡肟、替卡西林-克拉维酸、氨曲南的耐药性>45%。 42(22.7%)株细菌为多药耐药菌,其中24株为D型大肠埃希菌,6株为A型,4株为B2型,4株为B1型,4株为NT。A、B1、B2、D各型对头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、哌拉西林、头孢吡肟、氨曲南的耐药性与ESBLs产生有相关性( P值分别依次为0.032、0.002、0.010、0.001、0.000、0.000和 0.010)。见表2。

二、产ESBLs阳性率

185株细菌中,有145株细菌产ESBLs,产酶率为78.4%。其中,D型大肠埃希菌的产酶率最高,为91.3%,B2型、A型及B1型细菌的产酶率依次为78.0%、70.8%和68.8%,医院和社区获得性感染菌的产酶率分别为81.32%和78.02%。ESBLs主要由B2型医院获得性感染菌和D型社区获得性感染菌携带( P=0 .030和 P=0.000);A、B1、B2和D型在医院和社区感染菌中的分布差异无统计学意义( P值分别为0.337、0.946、0.316和0.339);多药耐药菌在医院和社区A、B1、B2和D各型中的分布差异无统计学意义( P=0 .693和 P=0.212);94株医院获得性感染菌和91株社区获得性感染菌在产ESBLs和多药耐药菌株的分布上差异亦无统计学意义( P=0.416和 P=0.908)。见表2、表3:

表2 尿路感染大肠埃希菌各种系分型对14种抗菌药物的耐药率、产ESBLs率及多药耐药率[株(%)]
表3 多药耐药、产ESBLs及
三、种系分型

185株细菌中D型最常见,有92株(49.7%),其次为B2型,有41株,A型24株,B1型16株,12株细菌为NT菌株。

四、遗传相关性

由Biomunerics软件构建的图谱表明,依据85%的折点,185株细菌间有很大的遗传多样性,52株尿路感染细菌的同源性见图1:

图1 52株尿路感染大肠埃细菌的REP-PCR图谱

讨论

与以往的研究结果[ 6]相比,本研究中尿路感染的菌株对左氧氟沙星、头孢噻肟、头孢吡肟的耐药率偏高,这可能和ESBLs在菌株中的广泛流行相关。值得注意的是,亚胺培南的耐药主要与A和D型大肠埃希菌相关,这可能与这2型菌株的多药耐药特点相关[ 7],或与膜通透性的下降及外排泵过度表达等机制的联合作用有关[ 8],具体的耐药机制有待于进一步分析。

种系分型是基于大肠埃希菌中一些比较稳定的表型或基因型特征进行分析的一种方法,由于细菌的各分型与耐药性、毒力基因和感染部位、细菌来源等有一定的相关性,在欧洲国家广泛应用。有研究表明,A和B1型细菌与尿路以外其他部位的感染有关,而A和D型细菌与多种抗菌药物耐药有关。欧美等学者研究表明,尿路感染主要由B2型大肠埃希菌引起,该型细菌与毒力基因密切相关,主要属于ST131[ 9],在国际上播散。韩国及西班牙的研究显示,D型大肠埃希菌为尿路感染的主要致病菌,B2型次之[ 10]。本研究显示,鼓楼医院尿路感染主要由D型大肠埃希菌引起,该型细菌与ESBLs的分布有关,与头孢噻肟、哌拉西林、头孢吡肟、氨曲南的耐药性密切相关。本研究也表明,A型大肠埃希菌与头孢他啶和亚胺培南的耐药相关,这可能与A型细菌的样本量少有关,也可能是A型细菌自身的耐药特点。此外本研究的初步结果显示,ESBLs主要由D和B2型大肠埃希菌携带,这需要我们进一步加大样本量来验证,以为我们进一步加强感染控制措施的实施提供方向。

REP-PCR 是通过扩增分析细菌基因组中广泛分布的短重复序列来揭示基因组间的差异。由于该方法分辨效果好,可重复性强,可自动化分型,目前已广泛应用于多种细菌基因分类[ 11]。本研究通过REP-PCR分析尿路感染大肠埃希菌的同源性发现,这些细菌之间有很大的遗传多样性,这表明尿路感染的大肠埃希菌来源多样化,这可能与患者来源广泛有关。此外本研究结果也表明,REP-PCR快速、简便,适用于大样本的遗传相关性分析。

在欧美国家,多药耐药菌主要播散于医疗环境中[ 12],与院内抗菌药物的使用产生的选择压力相关。而本研究表明,多药耐药菌和ESBLs在医院和社区环境中广泛播散,这需要我们进一步加强感染防控措施的实施,以预防这些细菌的爆发流行。

总之,本研究结果表明鼓楼医院尿路感染主要由D型大肠埃希菌引起,这些细菌具有很大的遗传多样性,且ESBLs的产生率高,广泛分布于医院和社区环境中。迫切需要规范医院和社区抗菌药物的使用,强化感染控制措施的实施,以减缓ESBLs的播散和耐药菌的发展。

The authors have declared that no competing interests exist.

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