引用本文
刘阳, 胡梅, 喻红波, 黎健. 肝癌患者外周血单个核细胞HLA-G表达研究. 28(12): 1088-1091[LIU Yang, HU Mei, YU Hongbo, LI Jian. Research on the expression of peripheral blood mononuclear cell HLA-G in patients with hepatocellular carcinoma. 上海检验医学, 28(12): 1088-1091]  
Permissions
Copyright©2014, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部版权所有
肝癌患者外周血单个核细胞HLA-G表达研究
刘阳1, 胡梅2, 喻红波1, 黎健1
1. 武警湖南总队医院检验科,湖南 长沙 410006
2. 湖南中医药大学生物化学教研室,湖南 长沙 410006

刘阳,男,1978年生,硕士,主管技师,主要从事分子生物学检验研究。

摘要
目的

了解肝细胞癌(HCC)患者外周血单个核细胞(PBMC)人类白细胞抗原G(HLA-G)的表达水平。

方法

收集38例HCC患者、25例肝硬化患者和40名健康查体者的PBMC,分别用逆转录-聚合酶链反应(PCR)和流式细胞术(FCM)检测其HLA-G mRNA和HLA-G蛋白表达水平。

结果

HCC组、肝硬化组和健康对照组PBMC HLA-G mRNA表达率分别为94.7%、84.0%和87.5%,差异无统计学意义(P=0.359);HCC组HLA-G蛋白表达率高于肝硬化组和健康对照组,差异有统计学意义(P=0.002)。HCC组PBMC HLA-G蛋白主要表达于CD4+细胞上。

结论

HCC患者PBMC HLA-G蛋白表达率升高,其机制与临床意义尚待进一步研究。

关键词: 人类白细胞抗原G; 肝细胞癌; 外周血单个核细胞
中图分类号:R446.62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)12-1088-04
Research on the expression of peripheral blood mononuclear cell HLA-G in patients with hepatocellular carcinoma
LIU Yang1, HU Mei2, YU Hongbo1, LI Jian
1. Department of Clinical Laboratory,Hunan Provincial Corps Hospital,Chinese 、People's Armed Police Forces,Hunan Changsha 410006,China
2. Department of Biochemistry,Hunan Traditional Chinese Medicine University, Hunan Changsha 410006,China
Abstract
Objective

To investigate the expression level of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) human leucocyte antigen G (HLA-G) in patients with hepatocellular carcinoma (HCC).

Methods

The HLA-G mRNA and HLA-G protein expression levels on PBMC from 38 patients with HCC,25 patients with liver cirrhosis and 40 healthy subjects were determined by reverse transcription-polymerase chain reaction (PCR) and flow cytometry (FCM).

Results

The HLA-G mRNA expression rates in HCC group,cirrhosis group and healthy control group were 94.7%,84.0% and 87.5%, respectively,and there was no statistical significance (P=0.359). The HLA-G protein expression rate in HCC group was significantly higher than those in cirrhosis and healthy control groups with statistical significance (P=0.002). In HCC group, the HLA-G protein was mainly expressed on CD4+ cells.

Conclusions

The PBMC HLA-G protein expression rate in HCC patients increases,and its mechanism and clinical significance need to be further researched.

Keyword: Human leucocyte antigen G; Hepatocellular carcinoma; Peripheral blood mononuclear cell
引言

人类白细胞抗原G(human leucocyte antigen G,HLA-G)属于人类主要组织相容性复合体非经典Ⅰ类分子,生理情况下主要局限性表达于胎盘滋养层细胞,通过抑制自然杀伤(natural killer, NK)细胞和T细胞功能在母胎界面的免疫耐受中起重要作用[ 1]。上世纪90年代发现许多恶性肿瘤表面高表达HLA-G分子,之后的研究认为肿瘤细胞亦通过与胎盘组织细胞相同的机制来逃避免疫监视,导致机体对其耐受[ 2, 3, 4]。以往对HLA-G在肿瘤免疫中作用的研究主要集中于肿瘤细胞,对肿瘤患者机体免疫细胞HLA-G的表达情况较少涉及。本研究探讨肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC) HLA-G表达情况及其与HCC的关系。

材料和方法
一、研究对象

2011年2月至2012年2月在武警湖南总队医院肿瘤中心就诊并行肝穿刺活检或术中活检经病理检查确诊为HCC的患者38例,传染病科收治的肝硬化患者25例以及经体检中心体检筛查的健康查体者40名。所有标本均为早晨抽取空腹静脉血,1∶9比例乙二胺四乙酸二钾抗凝,HCC患者标本均选用术前和化疗开始前的标本,即刻分离PBMC,-80 ℃冰箱保存。

二、方法

1. 试剂和仪器

人淋巴细胞分离液(Ficoll)、细胞裂解液(Trizol)购自深圳匹基公司;DNA Marker、逆转录-聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)试剂盒、Taq DNA聚合酶购自大连宝生物公司;溶血素购自美国Biolegend公司;藻红蛋白(phycoerythrin, PE)标记的小鼠抗人HLA-G分子单克隆抗体,异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记小鼠抗人类分子CD4+、CD8+分子单克隆抗体,AG22331型PCR仪购自德国Eppendorf公司;DYCP-34A型电泳仪购自北京沃德生物仪器公司;高速低温离心机购自Beckman公司; FACS Calibur型流式细胞仪购自美国BD公司。

2. PBMC HLA-G mRNA提取及逆转录PCR测定

Ficoll法提取抗凝血单个核细胞,裂解后Trizol法提取mRNA。从GenBank网站获取HLA-G基因序列,Premier5.0软件设计引物, HLA-G引物上游为5'-AGAGCACGGTCTGAATC-3',下游为5'-AGTTGCCGAACCAGTAGC-3',预期扩增片段长度80 bp。以内参照β-actin作为阳性对照,引物序列上游为5'- TTGCCGACAGGATGCAGAA-3',下游为5'- GCCGATCCACACGGAGTACT-3',预期扩增片段长度101 bp。 逆转录PCR反应参数为42 ℃ 60 min;95 ℃ 5 min。cDNA扩增的反应参数为95 ℃预变性1 min;然后进入循环,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s;40个循环。cDNA扩增过程中,以Buffer代替cDNA进行扩增,作为阴性对照。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳。

3. 流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测PBMC HLA-G蛋白表达

为每一乙二胺四乙酸二钾抗凝血标本准备3支试验管,每管加100 μL血标本,第1管中加入CD4+-FITC和HLA-G-PE各10 μL,标记为CD4+/HLA-G;第2管中加入CD8+-FITC和HLA-G-PE各10 μL,标记为CD8+/HLA-G;第3管中只加入HLA-G-PE 10 μL;另准备对照管,取10 μL IgG-FITC和10 μL IgG-PE抗体加入,标记为2-Color-Ctr。以2-Color-Ctr做为阴性对照,以标准微球调整仪器,使变异系数在2%以内。在前散射(forward scattering, FSC)和侧散射(side scattering, SSC)二维Dotplot图中,收集104个细胞,然后对淋巴细胞做FITC和PE的荧光强度检测,荧光强度以对数放大,光反射数据存盘。以FCS Express V3软件分析流式数据并做流式图。

三、统计学方法

使用SPSS 17.0统计软件进行结果分析。率的比较采用Pearson χ2检验,多个率比较采用行×列表的 χ2检验,多个率构成比之间的比较采用 χ2分割法检验。以 P<0.05为差异具有统计学意义。

结果
一、HCC组、肝硬化组与健康对照组HLA-G mRNA PCR检测结果

3组人群提取的总RNA经分光光度计测定,吸光度( A)260 /A280值均在1.8~2.0间;经2%琼脂糖变性电泳出现清晰5S、18S、28S条带,说明提取的RNA质量可靠。HLA-G与β-actin逆转录PCR产物的琼脂糖凝胶电泳均显示为单一条带,位置与产物预期扩增片段长度一致,表明PCR反应结果可靠。见图1:

图1 HLA-G 与β-actin PCR扩增产物电泳图

注:M为标准带;1为β-actin;2为HLA-G

试验结果表明,HCC组、肝硬化组和健康对照组均有较高的PBMC HLA-G mRNA表达阳性率,分别为94.7%、84.0%和87.5%,3组间阳性率差异无统计学意义( χ2=2.050, P=0.359)。见表1:

表1 HCC组、肝硬化组与健康对照组HLA-G mRNA表达情况
二、HCC组、肝硬化组和健康对照组HLA-G 蛋白FCM检测结果

HLA-G蛋白在3组人群PBMC上均有表达,但阳性率差异明显。HCC组PBMC有较高的HLA-G蛋白表达阳性率(42.1%),肝硬化组与健康对照组分别为16.0%和12.5%,3组间阳性率差异有统计学意义( χ2=10.521, P=0.005)。肝硬化组与健康对照组差异无统计学意义( χ2=0.074, P=0.785),将2组数据合并,与HCC组比较,差异有统计学意义( χ2=10.419, P=0.002)。见表2:

表2 HCC组、肝硬化组与健康对照组HLA-G FCM检测结果比较

全部25例PBMC HLA-G流式细胞仪表达阳性的标本中,HLA-G分子在CD4+细胞上均有表达,仅4例在CD8+细胞上表达。见图2:

图2 CD4+细胞HLA-G FCM检测散点图

注:a图为淋巴细胞圈定;b图为HCC患者流式图;c图为肝硬化患者流式图;d为健康对照者流式图

三、 HCC患者HLA-G蛋白表达率与临床病理参数的关系

分析HCC患者HLA-G蛋白表达率与临床病理参数的关系,结果见表3:

表3 不同临床特征的HCC患者HLA-G FCM检测结果

不同年龄、性别、肿瘤数量和分期的患者HLA-G FCM检测阳性表达率差异无统计学意义,而不同肿瘤大小和分化程度的患者HLA-G FCM检测阳性表达率差异有统计学意义( P<0.05)。

讨论

HLA-G分子通过抑制免疫活性细胞的功能在免疫耐受的建立和维持中发挥关键作用。肿瘤细胞形成后,可通过各种方式调节机体免疫状态,降低免疫功能,其中包括诱发抗原递呈细胞高表达抑制性受体,高强度结合HLA-G分子,引发“抑制性T细胞级联效应”[ 5, 6, 7, 8, 9],导致机体免疫系统对肿瘤的免疫耐受。有研究结果表明,HLA-G是导致肿瘤免疫细胞失能的直接原因之一[ 10, 11]。研究肿瘤患者HLA-G表达情况,有助于了解肿瘤细胞逃避免疫监视的机制。以往对HLA-G在肿瘤免疫中的作用主要聚焦于肿瘤细胞上表达的HLA-G在肿瘤免疫逃逸机制中的作用,近年来的研究发现机体免疫细胞上也可表达HLA-G分子,体液中的可溶性HLA-G分子 (sHLA-G)水平与肿瘤的发生、发展有关[ 12]。推测存在着肿瘤导致的免疫细胞过表达HLA-G分子,降低免疫监视功能以利于肿瘤生长的机制,但目前还少见这方面的研究。

本研究以HCC患者为研究对象,考察其免疫细胞HLA-G表达情况。在本研究中,HCC组、肝硬化组和健康对照组均有较高的PBMC HLA-G mRNA表达,徐亦君等[ 13]利用实时荧光定量PCR研究结肠癌患者PBMC HLA-G mRNA表达,结果亦表明HLA-G mRNA在PBMC中普遍表达,其研究还显示结肠癌患者HLA-G mRNA相对表达量高于良性病变和健康对照者。本研究结果显示HCC患者与肝硬化患者和健康对照者间HLA-G mRNA表达率没有明显差异,是否存在量的差异还需要试验印证。本研究显示PBMC HLA-G分子表达阳性率比HLA-G mRNA要低得多,表达率最高的HCC组也不及前者的一半,提示HLA-G在PBMC基因转录水平上普遍表达而在蛋白质水平上差异表达,推测PBMC HLA-G表达在基因转录后调控的某个环节(转录后加工、翻译或翻译后修饰)受到了调控。鉴于本研究还观察到HCC组PBMC HLA-G蛋白表达阳性率远高于肝硬化组和健康对照组,可以怀疑HCC细胞通过某种机制促进了此种影响,这还有待于进一步研究。本试验结果表明,不同年龄、性别、肿瘤数量和分期的患者HLA-G蛋白阳性表达率差异无统计学意义,而不同肿瘤肿块大小和分化程度的患者HLA-G蛋白阳性表达率差异有统计学意义,肿块大的HCC高于肿块小的HCC,分化程度低的HCC高于分化程度高的HCC,提示HCC对PBMC HLA-G表达的影响与HCC细胞数量和HCC的恶性程度有关。考察HLA-G分子在CD4+细胞和CD8+细胞上的表达情况,结果表明HLA-G分子主要表达于CD4+细胞上,提示HCC对PBMC HLA-G分子表达的影响主要集中于CD4+细胞上,对表达的CD4+细胞的亚型及其意义还有待进一步证实。

综上所述,HCC患者PBMC HLA-G分子有较高的阳性表达率,且主要表达于CD4+细胞上,并以此为基础对HCC发生、发展与PBMC HLA-G分子表达之间的关系做了假设推断,为进一步深入探讨HLA-G表达与HCC发生、发展之间的关系提供了思路。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Gonen-Gross T, Goldman-Wohl D, Huppertz B, et al. Inhibitory NK receptor recognition of HLA-G: regulation by contact residues and by cell specific expression at the fetal-maternal interface[J]. PLoS One, 2010, 5(1): e8941. [本文引用:1] [JCR: 3.73]
[2] Yan WH. Human leukocyte antigen-G in cancer: are they clinically relevant[J]. Cancer Letters, 2011, 311(2): 123-130. [本文引用:1] [JCR: 4.258]
[3] Zidi I, Ben Amor N. HLA-G regulators in cancer medicine: an outline of key requirements[J]. Tumour Biol, 2011, 32(6): 1071-1086. [本文引用:1]
[4] Morand i F, Scaruffi P, Gallo F, et al. Bone marrow-infiltrating human neuroblastoma cells express high levels of calprotectin and HLA-G proteins[J]. PLoS One, 2012, 7(1): e29922. [本文引用:1] [JCR: 3.73]
[5] 何维, 高晓明, 曹雪涛, 等. 医学免疫学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2005: 385. [本文引用:1]
[6] Suciu-Foca N, Manavalan JS, Scotto L, et al. Mole-cular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review[J]. Int Immuno-pharmacol, 2005, 5(1): 7-11. [本文引用:1]
[7] Rodríguez JA, Galeano L, Palacios DM, et al. Altered HLA class I and HLA-G expression is associated with IL-10 expression in patients with cervical cancer[J]. Pathobiology, 2012, 79(2): 72-83. [本文引用:1] [JCR: 1.948]
[8] Abediankenari S, Ghasemi M, Kim YJ. Human leukocyte antigen-G expression on dendritic cells induced by transforming growth factor-beta 1 and CD4+ T cells proliferation[J]. Iran Biomed J, 2011, 15(1-2): 1-5. [本文引用:1]
[9] 黄庆梅, 覃锦耀. CD4+CD25+细胞和CD8+CD28-调节性T细胞在原发性肝癌患者外周血中的水平变化[J]. 检验医学, 2010, 25(9): 705-707. [本文引用:1]
[10] Elliott RL, Jiang XP, Phillips JT, et al. Human leukocyte antigen G expression in breast cancer: role in immunosuppression[J]. Cancer Biother Radiopharm, 2011, 26(2): 153-157. [本文引用:1] [JCR: 1.738]
[11] Agaugué S, Carosella ED, Rouas-Freiss N. Role of HLA-G in tumor escape through expansion of myeloid-derived suppressor cells and cytokinic balance in favor of Th2 versus Th1/Th17[J]. Blood, 2011, 117(26): 7021-7031. [本文引用:1] [JCR: 9.06]
[12] Yie SM, Hu Z. Human leukocyte antigen-G (HLA-G) as a marker for diagnosis, prognosis and tumor immune escape in human malignancies[J]. Histol Histopathol, 2011, 26(3): 409-420. [本文引用:1] [JCR: 2.281]
[13] 徐亦君, 竺明晨. HLA-G在结肠癌外周血中的表达及其临床意义[J]. 中国肿瘤外科杂志, 2011, 3(6): 348-350. [本文引用:1]