乙型病毒性肝炎(简称乙肝)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染所致。HBV为嗜肝病毒,通过受感染者的血液或其他体液传播,引起肝细胞炎症、坏死、纤维化。乙肝分急性和慢性2种。急性乙肝在成人中90%可自愈,慢性乙肝可发展成肝硬化,甚至肝癌。乙肝在世界各国均有流行,我国属于高流行区。据统计,全球现有20多亿人感染过HBV,其中(3.5~4)亿人为慢性HBV携带者,我国有1.2亿人,估计每年约有60万人死于急性或慢性乙肝^{[ 1]}。我们从免疫学和基因学角度阐述乙肝疫苗的研究进展和未来的研制方向。

Krugman等^{[ 4]}首次证明将乙肝患者血浆中的22 nm病毒表面颗粒(HBsAg)加热接种黑猩猩,可诱导产生保护性抗体,并能抵抗HBV的攻击。20世纪70年代末至90年代,最初上市的是乙肝亚单位血源疫苗,是用HBsAg携带者血清中的表面抗原制成的,证明具有良好的安全性和免疫原性,美、法两国于1982年前后相继批准生产,我国于1985年正式批准生产。但是由于血液来源受限及其他感染因子的存在,卫生部决定自1998年6月30日停止血源乙肝疫苗的生产。

1981 年法国巴斯德研究所和美国西奈山医学中心在哺乳动物细胞中成功表达了HBsAg,巴斯德梅里厄公司(Pasteur Merieux ,PMSV)生产的中国仓鼠卵巢细胞 (Chinese hamsterovary cell ,CHO)重组乙肝疫苗(Genhevac2B)内含S和PreS2 2种抗原成分,对免疫抑制者可能有效^{[ 5, 6]}。1982年Valenzuela 等用啤酒酵母表达HBsAg获得成功。美国默克(MerckSharp &Dohme ,MSD)公司利用酵母表达技术生产出世界上第1支商品化的基因工程乙肝疫苗(Recom2bivax2B),其生产技术源于希隆(Chiron)公司,1986年该产品在德国上市,1987年通过美国药品和食品监督管理局批准在美国获准上市;随后,Biogen公司与英国的Edinburgh 大学生产出含有adw和ayw抗原的重组酵母乙肝疫苗(Engerix2B),并于1989年通过美国药品和食品监督管理局上市,该疫苗至少已在76个国家获得批准使用。1997年,史克必成公司研制出成人及儿童剂型甲乙型肝炎联合疫苗(TwinrixTM),并在许多国家获准使用,该疫苗由灭活甲肝疫苗和重组酵母乙肝疫苗组成^{[ 7]}。

1991年中国预防医学科学院病毒学研究所与长春生物技术研究所等单位合作,研制成功基因工程细胞乙肝疫苗,于1996年在长春生物制品研究所正式投产,1997年华北制药集团公司生产的基因重组乙肝疫苗也开始上市。该产品1993年获国家科学进步一等奖,目前主要由华北制药集团金坦、北京华尔盾、长春生物制品研究所、兰州生物制品研究所、武汉生物制品研究所和成都生物制品研究所等6家企业持有10个药品注册证,主要剂型是10、20 U的注射溶液和注射用氢氧化铝混悬液。1994年我国从默克公司引进酵母基因工程乙肝疫苗,由北京生物制品研究所和深圳康泰生物制品有限公司试生产,1997年被正式批准生产,并于1998年获得国家新药二类药品注册证,目前由北京天坛生物和深圳康泰生物2家企业生产,主要制品是15和1 mL氢氧化铝混悬液注射剂。

目前,我国从事乙肝疫苗业务的上市公司主要有广州药业、重庆啤酒、华兰生物、天坛生物和沃森生物。中国正在研究中的治疗性乙肝疫苗也有4个。第1种是上海复旦大学闻玉梅院士研究的抗原-抗体复合型疫苗,属于蛋白疫苗,是HBsAg和表面抗体(抗HBs)大概6比3混合佐剂,该疫苗正在进行三期临床试验。该课题组同时在研究DNA疫苗,但还没批准进行临床试验。第2种是第三军医大学全军免疫研究所吴玉章教授研究的多肽疫苗,是通过仿乙肝抗原的某些肽链诱导细胞产生抗体,该疫苗正在进行二期b临床试验。第3种是广州空军医院陈光明教授正在研究的DNA疫苗,是通过将仿乙肝抗原的序列连接到质粒载体中,在人体内内源表达抗原诱导细胞产生抗体,该疫苗已获得二期b临床试验批文,即将进行二期b临床试验。第4种是重组(汉逊酵母)乙肝疫苗(CpG佐剂)。沃森生物2009年7月申报临床批件。2011年2月,该疫苗10和20 μg 2个规格已获得国家药品和食品监督管理局药物临床试验批件。2011年12月7日公布了重庆啤酒乙肝疫苗的研究进展,分析数据认为乙肝疫苗无效果^{[ 7]}。

近日,孟颂东等对乙肝感染慢性化机制研究获进展。microRNA-122(miR-122)在肝脏中特异性表达,而且是肝细胞中丰度最高的小RNA,在肝脏功能和病理中发挥重要作用。中科院微生物研究所孟颂东研究员课题组新近的研究发现,miR-122可作为宿主限制性因子明显抑制病毒复制,而在乙肝慢性感染中由于慢性炎症和病毒感染引起miR-122下调。进一步研究查明,miR-122通过cyclin G1/p53通路对病毒复制起调控作用。基于以上研究,课题组提出乙肝感染慢性化的新机制:乙肝慢性感染下调宿主限制性小RNA,通过miR-122-cyclin G1/p53-病毒增强子通路促进病毒的表达与复制。这为进一步了解HBV的持续感染机制和肝癌发生途径提供了新的依据和阐释,同时提出miR-122作为治疗慢性乙肝的潜在新一代药物的可行性^{[ 8]}。

重组乙肝疫苗是采用基因工程技术将HBsAg的基因片段插入到受体细胞,在体外培养增殖过程中分泌HBsAg,将其收集、提纯加工后制成乙肝疫苗。Edman等^{[ 9]}将adw亚型的HBsAg基因置于酵母醇脱氢酶启动子的控制下,在啤酒酵母中表达HBsAg获得成功。

PreS1和PreS2蛋白即前S蛋白,在病毒感染、复制、装配和刺激机体产生免疫反应等方面有十分重要的作用。PreS1抗原可能是宿主免疫攻击的靶抗原,PreS2抗原是附加在HBsAg肽链末端前面的抗原决定簇,抗原性比HBsAg强^{[ 11]}。正常人的肝细胞膜上存在HBV PreS1抗原受体,能直接吸附HBV。PreS1蛋白的21~47位氨基酸序列中还富含比S更强的B细胞核T细胞表位。国外有学者发现 preS1基因表达的蛋白内含有3个T细胞识别位点,能引起体内针对PreS1、PreS2和S蛋白的B细胞增殖,产生多克隆抗体^{[ 12, 13]}。由PreS1蛋白引起的特异性细胞免疫应答可克服某些个体对S蛋白无反应或对S和PreS2蛋白无反应的缺陷。

近年来,人们对PreS2蛋白进行了深入的研究,发现其不仅在HBV附着及侵入肝细胞过程中起到关键性的作用,其肽段内含有T细胞受体的不同功能位点,特异性T、B淋巴细胞结合位点和Ⅰ、Ⅱ类主要组织相容性抗原限制性位点,能引起中和抗体和保护性免疫的产生,参与调节HBV引起的细胞及体液免疫,增强新型基因疫苗的免疫效应^{[ 14]}。PreS2外膜蛋白上存在多聚人血清白蛋白结合位点,具有吸附于肝细胞受体的决定簇,能特异性的与人血清白蛋白结合,再利用肝细胞表面的多聚人血清白蛋白受体,间接与肝细胞结合。含PreS2蛋白的疫苗可与HBV竞争结合多聚人血清白蛋白位点,从而阻断HBV感染肝细胞。

HBV PreS2抗原免疫原性较HBsAg强,而PreS1抗原可增强HBsAg免疫原性, 因而含有HBV PreS2和PreS1抗原成分或HBV的 S基因变异株核心蛋白成分的各种新型重组乙肝疫苗具有更大的免疫原性,能诱导更高效的免疫应答和抗体产生,中和HBV,保护机体免受病毒攻击,并可打破免疫耐受,清除HBV^{[ 11, 15]}。酵母细胞表达S 蛋白抗原的抗原性与哺乳动物细胞表达的抗原相差不多,但在表达PreS2/S、PreS1/PreS2/S时,由于细胞本身的限制,不能完成正确的转录后加工和修饰,如不能形成正确的分子折叠和糖基化等,免疫原性不如利用哺乳动物细胞表达的PreS2/S、PreS1/PreS2/S高,因而此种疫苗多选用哺乳动物细胞表达系统生产^{[ 16]}。目前巴斯德梅里厄公司生产的含PreS2/S 抗原的基因重组乙肝疫苗(Gen2hevac2B)在法国已大面积推广使用, 哺乳动物细胞表达的PreS1/PreS2/S(分别在CHO和小鼠细胞中表达)基因工程乙肝疫苗在以色列、新加坡、英国和一些西欧国家已获准上市。

造成疫苗无效的原因主要有以下几方面:(1)免疫因素。当前有研究发现,无或弱应答者辅助性T细胞与诱导性T细胞的比值显著降低。Th1细胞数明显减少,导致α干扰素、白细胞介素2分泌下降,不能介导正常的细胞免疫应答;(2)疫苗因素。抗原纯度、佐剂、灭活方法、贮存条件等均会对疫苗造成影响;(3)机体因素。性别、年龄、体重和遗传等方面的因素会对疫苗造成影响;(4)接种情况。接种的时间、途径、剂量、次数等会造成免疫无效。

研制新型乙肝疫苗时可以使用优化的免疫辅助因子,如干扰素、CpG、PADRE等,与前S和S抗原联合免疫,并针对机体的遗传及免疫因素,通过研究新型佐剂,改良疫苗,调节机体免疫,增强前S和S抗原的免疫原性。HBV易突变,其基因变异株能够逃逸机体的免疫反应,含前 S基因在内的多个特异性表位组成的多价苗可以避免这种情况的发生。