引用本文
李友琼, 黄慧嫔, 覃桂芳, 黄春丽. 毛细管电泳在Hb CS-H病中的诊断价值. 28(11): 1034-1037[LI Youqiong, HUANG Huipin, QIN Guifang, HUANG Chunli. The diagnosis significance of capillary electrophoresis in hemoglobin CS-H disease. 上海检验医学, 28(11): 1034-1037]  
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毛细管电泳在Hb CS-H病中的诊断价值
李友琼1, 黄慧嫔1, 覃桂芳1, 黄春丽2
1.广西壮族自治区人民医院检验科,广西 南宁 530021
2. 灵山县妇幼保健院,广西 钦州 535400

李友琼,男,1979年生,硕士,主管技师,主要从事地中海贫血及其检测技术研究。

基金:广西卫生厅资助项目(桂卫Z2011449);
摘要
目的

探讨毛细管电泳分析仪在诊断血红蛋白(Hb)CS-H病中的应用价值。

方法

用Sebia Capillarys 2型毛细管电泳仪分别对经地中海贫血基因分析确诊的34例Hb CS-H病患者和70例非Hb CS-H病患者(包括42例-SEA/-α3.7、19例-SEA/-α4.2、7例Hb WS-H、2例Hb QS-H)进行Hb电泳。采用缺口聚合酶链反应(Gap-PCR)和反向斑点杂交的方法对2组患者进行地中海贫血基因分析。

结果

毛细管电泳分析Hb CS-H组的HbCS带含量为(1.89±1.33)%,HbH带含量为(1.07±0.86)%,HbA2带含量为(1.17±0.68)%;非Hb CS-H组均未能检测到HbCS带,有部分标本未检出HbH带,HbA2带含量为(1.81±1.21)%。2组HbA2带含量比较差异有统计学意义(P<0.05)。毛细管电泳仪诊断Hb CS-H病的敏感性和特异性分别为88.2%和100.0%,阳性预测值为100.0%,阴性预测值为94.6%,诊断效率为96.2%,与地中海贫血基因分析比较差异无统计学意义(P=0.134)。

结论

毛细管电泳可以用来快速诊断Hb CS-H病,能够为患者减轻部分经济负担。

关键词: 毛细管电泳; 地中海贫血; 血红蛋白CS型H病; 血红蛋白病
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)11-1034-04
The diagnosis significance of capillary electrophoresis in hemoglobin CS-H disease
LI Youqiong1, HUANG Huipin1, QIN Guifang1, HUANG Chunli2
1.DepartmentofClinicalLaboratory,thePeople'sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,GuangxiNanning 530021,China
2.LingshanHealthCenterforWomenandChildren,GuangxiQinzhou 535400,China
Fund:
Abstract
Objective

To investigate the application significance of capillary electrophoresis analyzer in the diagnosis of hemoglobin(Hb) CS-H disease.

Methods

A total of 34 patients with Hb CS-H disease confirmed by thalassemia genetic analysis and 70 patients with non Hb CS-H disease (including 42 cases of -SEA/-α3.7,19 cases of -SEA/-α4.2,7 cases of Hb WS-H and 2 cases of Hb QS-H) were determined for Hb with Sebia Capillarys 2 capillary electrophoresis. The thalassemia genetic analysis of the 2 groups was conducted by gap-polymerase chain reaction (Gap-PCR) and reverse dot blot hybridization.

Results

The HbCS and HbH contents of Hb CS-H group were (1.89±1.33)% and (1.07±0.86)%,and the HbA2 content was (1.17±0.68)%. However,the samples with HbCS and a part of HbH were not detected in non-Hb CS-H group,and the HbA2 content was (1.81±1.21)%. Compared with Hb CS-H group and non-Hb CS-H group for HbA2,there were significant significance (P<0.05). Compared with the thalassemia genetic analysis,the sensitivity of capillary electrophoresis for the diagnosis of Hb CS-H disease was 88.2%,the specificity was 100.0%,the positive predictive value was 100.0%,the negative predictive value was 94.6%,the diagnosis efficiency was 96.2%,and there was no statistical significance (P=0.134).

Conclusions

The capillary electrophoresis can be used to the rapid diagnosis of Hb CS-H disease,and it will alleviate some of the economic burdens for patients.

Keyword: Capillary electrophoresis; Thalassemia; Hemoglobin CS-H disease; Hemoglobin disease
引言

血红蛋白(hemoglobin, Hb)H病主要是由于α珠蛋白肽链的4个 α基因中有3个发生了缺陷(包括基因缺失或点突变),α珠蛋白肽链合成量减少,使得红细胞受损而导致慢性溶血性贫血。从基因角度分类,Hb H病可以分为缺失型和非缺失型(点突变)[1]。国内缺失型Hb H病主要有东南亚缺失合并3.7缺失型(基因型为-SEA/-α3.7)和东南亚缺失合并4.2缺失型(基因型为-SEA/-α4.2);国内常见的非缺失型Hb H病有Hb CS-H病(基因型为-SEA/ααCS)、Hb WS-H病(基因型为-SEA/ααWS)和Hb QS-H病(基因型为-SEA/ααQS)。在国内,虽然Hb H病以缺失型为主,但是Hb CS也有一定的携带率[2],而且其引起的Hb H病的临床表现更为严重[3]。对于这种类型的Hb H病,目前临床实验室诊断主要是通过分子生物学技术[如缺口聚合酶链反应(gap-polymerase chain reaction, Gap-PCR)]进行。最近,利用毛细管电泳技术可以辨别和定量HbCS[4],使得诊断Hb CS-H病成为可能。我们旨在研究毛细管电泳这种诊断Hb CS-H病新技术的应用价值。

材料和方法
一、研究对象

选取2011年1至12月经地中海贫血基因诊断的104例Hb H病患者,其中Hb CS-H病34例,男13例,女21例,年龄2个月~37岁;以70例非Hb CS-H病(包括42例-SEA/-α3.7、19例-SEA/-α4.2、7例Hb WS-H病、2例Hb QS-H病)作为对照组,男23例,女47例,年龄5个月~58岁。

二、仪器和试剂

Sebia Capillarys 2型毛细管电泳分析仪及配套试剂、质控品(法国Sebia公司);C-1000型PCR扩增仪(美国Bio-RAD公司);K960型PCR扩增仪(杭州晶格公司);K30干浴器(杭州奥盛公司);HL-2000杂交炉(美国UVP公司);Gel Doc XR凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司);PowerPace Basic电泳仪(美国BIO-RAD公司);全血基因组DNA抽提试剂盒、PCR及反向斑点杂交试剂盒(深圳益生堂生物公司)。

三、毛细管电泳

用枸橼酸钾抗凝管抽取3 mL静脉血,颠倒混匀8次,立即送实验室检测。实验前,将Sebia Capillarys 2型毛细管电泳仪开机预热30 min,将试剂置于室温30 min。将标本离心去净上层血浆。按照Capillarys 2型毛细管电泳仪说明书操作,用厂家原配HbA2质控品进行定位和监控,使仪器处于良好的运行状态。标本检测均在4 h内完成。各条带的含量是以电泳所得Hb所有条带的峰值为100%时所占的比例表示。以标本均电泳出HbH和HbCS条带判定为Hb CS-H病。

四、全血基因组DNA的抽提

吸取65 μL全血和400 μL裂解液加入Eppendorf管,按全血基因组DNA抽提试剂盒说明书操作提取基因组DNA。

五、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳及反向斑点杂交

按PCR试剂盒说明书操作,吸取2 μL DNA模板加入25 μL PCR Mix,瞬时离心,α-地中海贫血缺失型基因扩增循环参数:94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,共35个循环;72 ℃ 5 min。吸取2 μL DNA模板加入45 μL PCR Mix,瞬时离心,α地中海贫血非缺失型及β地中海地贫血基因(点突变)扩增循环参数:94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 60s,共35个循环;72 ℃ 5 min。将2 μL α地中海贫血缺失型基因PCR扩增产物加入1%琼脂糖凝胶中进行电泳,SEA条带扩增片段为1 300 bp,3.7条带为2 000 bp,4.2条带为1 600 bp,正常对照条带为1 800 bp。按反向斑点杂交试剂盒说明书进行杂交反应,α-地中海贫血非缺失型及β地中海贫血基因(点突变)结果判断:如果膜上只有野生型位点出现蓝色斑点,标本为阴性;野生型和突变型位点都出现蓝色斑点,标本为点突变阳性(杂合子);野生型位点未出现蓝色斑点,而突变型位点出现蓝色斑点,标本为点突变阳性(纯合子);α地中海贫血非缺失型如果2条肽链都有缺失大片段,将出现模条白板。

六、结果分析

诊断检测评价指标:敏感性= a/( a+c) ×100 %,特异性 =d/( b+d) ×100 %,准确度 =( a+d) /( a+b+c+d) ×100 %,阳性预测值 =a/( a+b) ×100 %,阴性预测值 =d/( c+d) ×100 %,其中 a为毛细管电泳检测Hb CS-H组的阳性数;b为检测非Hb CS-H组的阳性数; c为检测Hb CS-H组的阴性数; d为检测非Hb CS-H组的阴性数。

七、统计学方法

应用SPSS17.0统计软件进行数据分析,计量资料以 ±s表示,Hb CS-H组与非Hb CS-H组的Hb组分平均含量比较用独立样本 t检验;地中海贫血基因分析与毛细管电泳检测结果比较用 χ2检验。 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、毛细管电泳检测结果

以Gap-PCR、PCR加上反向斑点杂交结果为金标准,毛细管电泳敏感性为88.2%、特异性为100.0%、阳性预测值为100.0%、阴性预测值为94.6%,诊断效率为96.2%,假阴性为11.8%。2种方法检测结果差异无统计学意义( P=0.134)。见表1:

表1 毛细管电泳与基因分析诊断Hb CS-H病的结果(例)
二、Hb组分的定量

Hb CS-H 组有4例未能诊断出Hb CS-H病,其中有1例未能电泳出HbCS和HbH带,有2例能电泳出HbH带而未能电泳出HbCS带,有1例能电泳出HbCS 带而未能电泳出HbH带。HbCS 带含量为(1.89±1.33)%,HbH带含量为(1.07±0.86)%,HbA2带含量为(1.17±0.68)%。非Hb CS-H 组均未电泳出HbCS带,28例未电泳出HbH带,HbA2带含量为(1.81±1.21)%。2组HbA2带含量比较差异有统计学意义( P<0.05)。Hb CS-H病与非Hb CS-H病的毛细管电泳图谱见图1:

图1 Hb CS-H病与非Hb CS-H病的毛细管电泳图谱

注:a图为Hb CS-H病;b图为非Hb CS-H病

讨论

α地中海贫血可以分为静止型、轻型、中间型和重型4种类型,Hb H病属于中间型,Hb电泳部分可以检测到HbH带。中间型地中海贫血具有较大的异质性,临床表现从轻度贫血到重度贫血,甚至是巴氏胎儿水肿综合征[5,6]。Hb CS-H病一般都是中度贫血,如果是儿童则会影响其生长发育。由于HbCS携带者的表型较轻,使用普通的检测手段和仪器容易漏诊,生育下一代存在风险,而采用毛细管电泳则可以检测到这类携带者[7,8],还能够检测出Hb CS-H病。

本研究中34例确诊的Hb CS-H病患者采用毛细管电泳可以检测出30例,敏感性达88.2%,特异性达100.0%,与地中海贫血基因分析相比较,检测结果差异无统计学意义( P=0.134)。在未检测出的4例中,有1例血液科门诊患者未能检测出HbCS带和HbH带,因其临床资料有限,无法研究其原因。有2例患者可以检出HbH带而不能检出HbCS带,由于这2例患者均为儿童(其中1例为2个月,1例为6岁),推测是不是这2例患儿的α珠蛋白肽链合成速率较低,暂时还未能检测到HbCS带。还有1例血液病患者能够检测到HbCS带而不能检测到HbH带,则可能是由于HbH属于不稳定Hb,因HbH降解而不能检测到。

一般人都认为Hb H病一定能够检测到HbH带。实际上,在临床工作中我们发现,Hb H病未能检测到HbH条带的现象还是存在的,特别是非Hb CS-H组中比较常见,目前尚未有这方面的深入研究的报道。7例Hb WS-H病标本中Hb电泳均未见到HbH条带,2例Hb QS-H病中有1例未检出。42例-SEA/-α3.7中有14例未能检出HbH条带(包括2例合并了β地中海贫血;资料显示,合并β地中海贫血的Hb H病均不能检测出HbH带),19例-SEA/-α4.2中有4例未能检出HbH条带。虽然没有检测出HbH带,但是其另一个Hb组分HbA2的含量低于健康人,这样也可以初步筛查出可疑的Hb H病。 Hb CS-H组与非Hb CS-H组相比,除了能够筛查出HbCS外,2组HbA2带含量比较差异也有统计学意义( P<0.05)。只要毛细管电泳同时检测出的HbCS和HbH条带,基本上可以诊断为Hb H病,出现贫血的患者只需要对症治疗。如果没有生育要求的患者,无需进行下一步地中海贫血基因诊断(该项检测价格比较昂贵)。从这些资料可以看出,毛细管电泳筛查Hb CS-H病有着明显的优势,而且也比较容易区分合并有HbCS和非HbCS的Hb H病。利用毛细管电泳筛查地中海贫血,方便、快速,能够为Hb CS-H病的患者减轻一部分的经济负担。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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