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张丽萍, 刘元明, 张金红, 宋娜, 郝钦芳, 杨晓莉. 自制他克莫司室内质控品的制备及临床应用研究. 2013, 28(11): 1021-1025[ZHANG Liping, LIU Yuanming, ZHANG Jinhong, SONG Na, HAO Qinfang, YANG Xiaoli. The preparation and clinical application research of self-made tacrolimus internal quality control material. 上海检验医学, 2013, 28(11): 1021-1025]  
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自制他克莫司室内质控品的制备及临床应用研究
张丽萍, 刘元明, 张金红, 宋娜, 郝钦芳, 杨晓莉
武警总医院检验科,北京 100039

张丽萍,女,1975年生,学士,主管技师,主要从事全血药物浓度监测、病毒学检测、自身免疫性疾病抗体检测工作。

摘要
目的

完善他克莫司(FK506)室内质控品水平,弥补商用质控品监测盲区。

方法

观察1年内FK506检测结果,评估自制低值质控品用于临床的可行性;运用临床患者标本自制低值室内质控品(ZCON-L)和自制中值室内质控品(ZCON-M),检测其日内、日间相对标准差(RSD%),并与低值商用质控品(Level 1)、中值商用质控品(Level 2)比较,并绘制室内质控图;将ZCON-M和Level 2做统计学分析,评估自制质控品与商用质控品是否有差异;将ZCON-L、ZCON-M分别放于4、25和37 ℃环境内连续检测7 d,观察不同温度环境对其影响;经无菌分装后的自制质控品置于-30 ℃保存,每周取1支复融后随日常工作检测,检测完毕后置4 ℃保存,经10个月连续检测,观察其稳定性。

结果

1年内9 975人次的FK506检测中,约有28.4%处于商用质控品监测盲区;ZCON-L、ZCON-M的日内RSD分别为4.5%、5.3%,日间RSD分别为7.06%、5.37%,符合ARCHITECT i1000全自动免疫分析仪的性能指标及《中国药典》生物标本分析方法RSD<15%的要求; ZCON-L、ZCON-M与Level 1、Level 2的相关性较好(r2=0.835 2、0.818 5),并且在质控图中走势一致;ZCON-M与Level 2经t检验,二者之间差异无统计学意义(P>0.05);4、25和37 ℃环境温度在7 d内对自制质控品影响较小;经连续10个月观察,ZCON-L、ZCON-M总RSD分别为7.56%、4.97% 。

结论

自制FK506室内质控品稳定性好,与商用质控品无差异,与商用质控品联合应用于临床,可弥补商用质控的监测盲区,完善室内质量控制水平。

关键词: 自制质控; 室内质量控制; 他克莫司
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)11-1021-05
The preparation and clinical application research of self-made tacrolimus internal quality control material
ZHANG Liping, LIU Yuanming, ZHANG Jinhong, SONG Na, HAO Qinfang, YANG Xiaoli
Department of Clinical Laboratory, General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces, Beijing 100039,China
Abstract
Objective

To improve tacrolimus (FK506) internal quality control material, and remedy the monitoring blind of commercial ones.

Methods

The results of FK506 were observed in 1 year,and the feasibility of self-made low-level quality control material was evaluated. By self-made internal quality control material of low level (ZCON-L) and self-made internal quality control material of middle level (ZCON-M), the intra-day and inter-day relative standard deviations (RSD%) were determined. The differences between low-level and middle-level commercial internal quality control materials (Level 1 and Level 2) and self-made ones were compared. The internal quality control chart was drawn,the ZCON-M and Level 2 were analyzed statistically,and the difference of self-made internal quality control material and commercial ones was analyzed. The ZCON-L and ZCON-M were put at 4,25 and 37 ℃ and monitored for 7 d, and the influence of temperature was observed. The self-made internal quality control material were subpackaged biocleanly and stored at -30 ℃, someone was took out every week, after thawing, it was monitered following the routine works, and stored at 4 ℃. Monitoring for 10 months, the stability was observed and analyzed.

Results

Among 9 975 determinations of FK506 in 1 year, there was about 28.4% in the monitoring blind. The intra-day RSD and inter-day RSD of ZCON-L and ZCON-M were 4.5%,5.3%and 7.06%, 5.37% respectively,conforming to the performance indicators of ARCHITECT i1000 automatic immunoassay analyzer and the requirement of RSD<15% of biological sample analysis method intheChinesePharmacopoeia. The correlations between ZCON-L,ZCON-M and Level 1, Level 2 were good (r2=0.835 2 and 0.818 5), and their trends were consistent in the internal quality control chart. ZCON-M and Level 2 had no statistical significance byt test (P>0.05). The temperatures (4,25 and 37 ℃) in 7 d had less effect to the self-made internal quality control material. The total RSD of ZCON-L and ZCON-M in 10 months were 7.56% and 4.97%.

Conclusions

The stability of self-made FK506 internal quality control material is good,it has no difference with commercial ones,it can be used in the clinical determination, so it can remedy the monitoring blind of commercial internal quality control materials and make up the internal quality control.

Keyword: Self-made internal quality control material; Internal quality control; Tacrolimus
引言

他克莫司(tacrolimus)简称FK506,是一种大环内酯类强效免疫抑制剂,因其具有抑制作用强和高移植存活率等优点,在临床器官移植中应用日趋广泛[ 1]。但FK506治疗窗窄,而且个体差异较大,故器官移植术后的患者需长期频繁监测药物浓度,为确保检测结果的质量,临床实验室通常施行室内质量控制,不但能及时发现各种检测误差,还能找出引起误差的原因并及时纠正,为临床医生提供可靠实验数据。但商用质控品的检测范围不能满足临床需要,常使低值结果处于监测盲区,为完善室内质量控制,本实验室自行配置FK506低值室内质控品,现将配置方法以及其精密度、稳定性等参数进行分析,用以评估该质控品应用于临床的可行性。

材料和方法
一、材料

1. 仪器

ARCHITECT i1000全自动免疫分析仪由雅培公司生产,该仪器采用化学发光微粒免疫检测技术检测全血FK506浓度。

2. 涡旋混合器

VDSTEX 5型涡旋混合器,由江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产。

3. 离心机

Centrifuge 5424D台式离心机,德国Eppendorf公司产品。

4. 生化摇摆平台

由上海长江生化仪器有限公司生产,型号为BT-2.0。

5. 超净工作台

国产,型号为YATAIKELONG的超净工作台。

二、质控品

1. 试剂

FK506检测试剂盒由雅培公司生产,批号为86600M500,有效期至2011年10月14日;FK506校标液,批号为47K04410,有效期至2011年6月1日;雅培Tacrolimus专用全血沉淀剂,批号为521969,有效期至2011年6月1日。

2. 商用质控品

雅培-MCC多种药物浓度混合型质控,由Abbott Laboratories生产,批号为95050,有效期至2013年3月31日。分为3个浓度水平:商用质控品低值(Levels 1) 靶值为5.1 ng/mL,检测范围为3.6~6.7 ng/mL;商用质控品低值(Levels 2) 靶值为11.0 ng/mL,检测范围为7.7~14.3 ng/mL;商用质控品低值(Levels 3) 靶值为21.7 ng/mL,检测范围为15.2~28.2 ng/mL。

3. 自制质控品的来源

配制自制质控品的临床标本来源于武警总医院2010年3月1日至2010年3月30日肝或肾移植术后或术后3个月门诊随访患者的全血标本,共200例。

4. 制作自制质控品的标本筛选标准

标本在服药前采集,检测结果为药物谷浓度;为乙二胺四乙酸二钾抗凝的3 mL全血标本,无凝集现象;标本采集后,即刻用ARCHITECT i1000全自动免疫分析仪检测FK506。

5. 自制质控分组标准

在室内质控在控情况下,选取符合筛选标准的标本,其检测结果处于1.0 ~ 4.0 ng/mL的标本作为自制低值室内质控品(ZCON-L)组;9.0~13.0 ng/mL的标本作为自制中值室内质控品(ZCON-M)组;ZCON-L组的标本检测结果均低于本室内商用质控品检测的最低值;ZCON-M组的标本检测结果在本实验室商用质控品的±2 SD范围内。

6. 试剂说明书

ARCHITECT i1000全自动免疫分析仪检测FK506浓度试剂说明书。

三、方法

1. FK506浓度分布情况

回顾分析武警总医院2010年6月至2011年6月1年内所有FK506浓度的分布情况,评估自制低值浓度质控品的必要性。

2. 自制质控品的制备

每日选取检测结果在1.0 ~ 4.0 ng/mL和9.0~13.0 ng/mL范围内的标本-30 ℃冷冻保存;当临床标本分别达到100例时,置室温复温,置涡旋混合器混匀后,将2组标本分别倒入无菌玻璃瓶内,浓度范围在1.0~4.0 ng/mL的标本,作为ZCON-L组,浓度处于9.0~13.0 ng/mL的标本作为ZCON-M组。然后置于生化摇摆台上,室温混匀12 h后,再次放置-30 ℃冰箱冷冻24 h,然后室温放置,复融后置于生化摇摆台上混匀12 h;如此反复多次冻融、混匀,直至自制质控品完全混匀并溶血,标本整体呈暗红色透明液体;按每管1.5 mL分装至一次性塑料带帽离心管中,分装后的自制质控品在-30 ℃冷冻保存,每周取1支,随日常工作检测,检测完毕后置4 ℃保存;在配置过程中不需加任何防腐剂,且配置、分装、取样检测的过程中必须保持无菌操作。

3. 日内相对标准差(relative standard deviations, RSD)检测

严格按照ARCHITECT i1000全自动免疫分析仪检测FK506试剂说明书,前处理ZCON-L和ZCON-M,各20次,然后在ARCHITECT i1000全自动免疫分析仪上检测,记录结果,计算其日内RSD,并与ARCHITECT i1000全自动免疫分析仪说明书中的产品性能指标比较。

4. 日间RSD

每日随日常工作检测ZCON-L、ZCON-M、Levels 1、 Levels 2各1次,检测完毕后立即将质控品放入4 ℃保存,共检测20 d,记录结果,计算日间RSD,绘制ZCON-L与Level 1、ZCON-M与Level 2的散点图及质控图。

5. 稳定性观察

取已分装的ZCON-L、ZON-M分别放置4 ℃、室温(±25 ℃)及37 ℃水浴箱中,每日随日常标本检测1次,检测7 d,观察其在不同环境中的稳定性;所有经无菌分装后的自制质控品在-30 ℃冷冻保存,每周取用1支,随日常标本每天检测ZCON-L、ZCON-M各1次,检测完毕后即放置4 ℃保存,经10个月连续监测,观察其稳定性及RSD。

四、统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量数据以 ±s表示,统计方法为配对 t检验、两变量的相关和回归。 P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、FK506浓度分布情况

1年内武警总医院共检测FK506浓度9 975人次,浓度分布情况见图1:

图1 FK506浓度分布情况

商用质控品Levels 1靶值为5.1 ng/mL,允许范围3.6~6.7 ng/mL,但本室实际检测靶值为4.9 ng/mL,范围仅在4.22~5.58 ng/mL;ZCON-L的检测靶值3.2 ng/mL,检测范围2.7~3.7 ng/mL;观察1年来FK506浓度,结果≤ 4.2 ng/mL(商用质控品监测最低限)有2 836人次,占总人数的28.4%;检测结果≤ 2.7 ng/mL(自制质控品监测最低限)有1 132人,占总人数的11.3%。

二、日内RSD检测

经过连续20次检测,所测结果见表1:

表1 自制质控品与ARCHITECT i1000全自动免疫分析仪说明书的性能指标比较

ZCON-L的日内RSD为4.5%,ZCON-M的日内RSD为5.3%;ARCHITECT i1000全自动免疫分析仪说明书中产品性能指标显示,当FK506浓度处于3.0 ng/mL时,日内RSD为3.7%;浓度处于11.4 ng/mL时,其日内RSD为4.1%;ZCON-L、ZCON-M的日内RSD与ARCHITECT i1000全自动免疫分析仪说明书中产品性能指标相近。

三、日间RSD检测

经过连续20 d的测定,结果见表2:

表2 自制质控品与商用质控品的批间RSD比较

ZCON-L、ZCON-M日间RSD分别为7.06%、5.37%,符合《中国药典》生物标本分析方法RSD应<15%的要求。ZCON-L的平均值( )虽然低于Level 1,但 SD及RSD相近,经相关性分析,相关系数( r2)=0.835 2,见图2:

图2 自制质控品与商用质控品的相关性比较

Level 2与ZCON-M平均值相近, SD和RSD相差较小,Level 2 与 ZCON-M差异无统计学意义( P>0.05)。分别绘制ZCON-L和Level 1、ZCON-M和Level 2的室内质控图,自制质控品发展趋势与商用质控品吻合。见图3:

图3 自制质控品与商用质控品室内质控图

四、稳定性

取已分装的ZCON-L、ZON-M分别放置4、25和37 ℃温度环境中,每日随日常标本检测1次,共检测7 d,结果见图4、表3:

图4 自制质控品在不同环境温度中的稳定性观察

表3 自制质控品不同环境中的稳定性观察(ng/mL)

在不同温度环境中,自制质控品的变异系数(coefficient of variation, CV)均低于4.0%,其稳定性良好;经过10个月的连续检测,ZCON-L总 为3.22,检测范围为2.74~3.70 ng/mL,总RSD为7.56%;ZCON-M 总 为11.66,检测范围为10.50~12.70 ng/mL,总RSD为4.97%。见表4:

表4 自制质控品长期稳定性观察

讨论

FK506是目前临床上应用较为广泛的大环内酯类强效免疫抑制剂,但由于治疗窗窄,个体差异大,使得器官移植术后的患者需长期频繁地监测血药浓度,为了保证检测结果的质量,实验室会随日常工作检测定值的室内质控品。现在国内大部分实验室将商用质控品作为室内质控品,然而商用质控监测范围有限,尤其是低浓度水平,靶值为5.1 ng/mL,允许范围为3.6~6.7 ng/mL,而本室实际检测靶值仅为4.9 ng/mL,检测范围为4.22~5.58 ng/mL;经过对FK506检测结果1年的观察,约有28.4%患者检测结果≤4.2 ng/mL,如果仅使用商用质控品,会使约三分之一的患者标本处于质量监测盲区。而自制室内质控品ZCON-L的靶值为3.2 ng/mL,检测范围为2.7~3.7 ng/mL,其监测盲区仅为11.3%,自制质控品可使商用质控品的检测盲区降低约17.1%。目前,关于FK506自制室内质量控制品在国内没有相关的经验报道。

在配置质控品过程中,无菌操作是关键,即配置的容器及制备过程中取样的微量移液器枪头必须经过高压灭菌,在混匀过程中尽量不与外界接触,取样及分装要在超净台中完成;我们在配置初期曾出现过待分装标本被污染情况,导致监测结果极为不稳定并有异味。如果在配置过程中出现了或者怀疑被污染情况时,建议应重新配置。其次,在制备过程中标本的混匀与溶血也非常重要,因为血浆中FK506浓度只占整个全血浓度的15%~25%,大部分药物连接在红细胞上[ 2],所以在配置时要将其反复充分混匀,并使其彻底溶血后,才可用于日内及日间RSD实验。如果测试结果( )不理想时,可将选取的新鲜标本经冷冻、复融、完全溶血后,再用于浓度的调节。经过调节后,自制质控品必须再次经充分混匀后方可测定。

由于器官移植术后的患者FK506药物浓度常处于低、中浓度范围[ 3],故本室只配制了ZCON-L和ZCON-M 2个浓度水平,将ZCON-M作为参照组,以验证自制质控品与商用质控品是否有差异,经实验证明ZCON-M和LeveL2的检测结果相近,差异无统计学意义( P>0.05),由此可认为自行配制的室内质控品与商用质控品无差异。

通过对自制质控品日内、日间RSD的测定,以及与商用质控品的实验比较得出,自制质控品日内、日间RSD<10%,符合《中国药典》生物标本分析方法RSD应<15%的要求[ 4]。将ZCON-L 与Level 1、ZCON-M与Level 2的日间RSD检测结果分别绘制质控图,可见自制质控品与商用质控品的符合性很好,结果走势一致,即当商用质控品的结果呈上升或下降趋势时,自制质控品也会出现相应的上升或下降,经相关性分析, r2=0.835 2、0.818 5,自制质控品与商用质控品相关性良好。

自制质控品分装量为7次检测量,故不同贮存温度的稳定性试验只检测7 d,虽然在室温及37 ℃环境中的检测结果 CV略高于4 ℃,但总体看来,不同环境温度中的检测结果 CV均低于4%;经过连续10个月的稳定性观察,自制质控品稳定性良好,总RSD控制在4.0%~8.0%之间。

总之,自制FK506室内质控品来源于临床患者标本,排除了因工艺问题而导致的与临床标本的差异,使其更贴近于临床患者药代学模式,并且自制质控品配制方便,不需要特殊的工艺处理,可大量制备;其日内、日间RSD均符合《中国药典》生物标本分析方法的要求,稳定性良好,与商用质控品联合应用,可弥补商用质控品的监测盲区,基本上做到全程、全浓度监测FK506的检测质量。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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