引用本文
赵百慧, 王春, 滕峥, 沈佳仁, 高烨, 俞雪莲, 张泓, 张曦. 儿童下呼吸道人类博卡病毒感染的病毒载量和疾病严重程度相关性研究. 28(11): 1016-1020[ZHAO Baihui, WANG Chun, TENG Zheng, SHEN Jiaren, GAO Ye, YU Xuelian, ZHANG Hong, ZHANG Xi. The correlation study of HBoV viral load and disease severity in children with lower respiratory tract infections. 上海检验医学, 28(11): 1016-1020]  
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儿童下呼吸道人类博卡病毒感染的病毒载量和疾病严重程度相关性研究
赵百慧1, 王春2, 滕峥1, 沈佳仁1, 高烨1, 俞雪莲1, 张泓2, 张曦1
1. 上海市疾病预防控制中心微生物实验室, 上海 200335
2. 上海市交通大学医学院附属儿童医院检验科, 上海 200040

赵百慧,女,1978年生,硕士,主管技师,主要从事流感病毒和其他呼吸道病毒研究。

张曦,联系电话:021-62758710-2605。

基金:上海市卫生局青年科研项目(20124y184); 上海市卫生微生物公共卫生重点学科(12GWZX0801);
摘要
目的

研究下呼吸道感染患儿人类博卡病毒(HBoV)载量与疾病严重程度的相关性。

方法

对2009年1月至2012年9月间554例因下呼吸道感染住院的5岁以下患儿及195名健康对照组儿童下呼吸道吸出物(NPAs)、鼻咽拭子采用荧光聚合酶链反应(PCR)检测HBoV种类,并同时测定阳性标本感染HBoV的载量,利用商品化试剂盒检测其他种类的呼吸道病毒,结合患儿的临床症状和生化指标进行综合分析。

结果

实验组与健康对照组HBoV阳性率有明显差异,实验组病毒载量(5.10×106拷贝/mL)明显高于对照组(2.70×103拷贝/mL,P<0.05)。实验组中混合感染组疾病严重程度为一般和中等的患儿HBoV载量(分别为2.70×105、3.85×106拷贝/mL)明显低于严重患儿(8.70×106拷贝/mL,P<0.05)。在1例新生儿重症肺炎患儿NPAs、血液和粪便中均检测到HBoV,并排除了其他常见呼吸道病毒和细菌感染。

结论

HBoV是呼吸道疾病致病病原,混合感染中HBoV载量与疾病严重程度呈正相关,HBoV在某些患儿中可以导致重症肺炎。

关键词: 人类博卡病毒; 病毒载量; 重症肺炎; 儿童
中图分类号:R373.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)11-1016-05
The correlation study of HBoV viral load and disease severity in children with lower respiratory tract infections
ZHAO Baihui1, WANG Chun2, TENG Zheng1, SHEN Jiaren1, GAO Ye1, YU Xuelian1, ZHANG Hong2, ZHANG Xi1
1.MicrobiologyLaboratory,ShanghaiMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Shanghai 200335,China
2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiChildrenHospital,Shanghai 200040,China
Fund:
Abstract
Objective

To study the correlation of human bocavirus (HBoV) viral load and disease severity in children with lower respiratory tract infections.

Methods

Nasopharyngeal aspirates(NPAs) from 554 in-hospital children with lower respiratory tract infections under 5-year-old and swabs from 195 healthy children were collected from January 2009 to September 2012. The types of HBoV and HBoV viral load were determined by fluorescence polymerase chain reaction (PCR). The other respiratory viruses were determined by commercial kits. The results were analyzed with clinical symptoms and biochemistry parameters.

Results

The positive rates of HBoV between in-hospital children and healthy children had obvious difference. The HBoV viral loads of in-hospital children (5.10×106 copies/mL) were significantly higher than those of healthy children (2.70×103 copies/mL,P<0.05). Among co-infection in-hospital children, the HBoV viral loads of mild and moderate groups (2.70×105 and 3.85×106 copies/mL) were lower than that in severe group (8.70×106 copies/mL,P<0.05). There was 1 case of newborn infant with severe pneumonia, and HBoV were found in NPAs, blood and stool samples without other common respiratory trract virus and bacterium infections.

Conclusions

HBoV is a pathogen for respiratory tract disease in children. HBoV viral load is correlated positively with disease severity in co-infection patients. HBoV can cause severe pneumonia in some children.

Keyword: Human bocavirus; Viral load; Severe pneumonia; Child
引言

人类博卡病毒(human bocavirus, HBoV)属于细小病毒科博卡病毒属,是瑞典学者Allander等[ 1]2005年从儿童呼吸道感染标本中首先发现的。到目前为止,HBoV已经报道4个型别,分别命名为HBoV1~4。其中HBoV1主要存在于呼吸道标本中,引起呼吸道症状,其他3个亚型主要存在于粪便标本中[ 2, 3]。因HBoV1常与其他呼吸道病毒混合感染,其致病性一直存在争议。另外HBoV在体外培养困难也阻碍了对其致病机制的研究。最近有2例个案报道提示HBoV1可能导致严重呼吸道感染,目前少有HBoV在儿童下呼吸道感染中所起的作用和其病毒载量与疾病严重程度的相关性报道,有必要展开进一步研究。

材料和方法
一、研究对象

选取2009年1月至2012年9月上海市儿童医院呼吸内科和重症监护病房(intensive care unit, ICU)因下呼吸道感染住院患儿554例,男328例,女226例,选择标准为:年龄≤5岁,X线确认为支气管炎和/或肺炎,排除基础性疾病,如肾病、血液病、心血管疾病等。健康对照者195名,男102名,女93名,使用上海市疾病预防控制中心标本库中保存的2010年上海市静安区3个托幼机构儿童的鼻咽拭子标本,健康对照者的年龄均≤5岁。患儿临床资料、常规检验指标、生化指标和细菌培养结果登记到统一设计的表格中。

二、方法

1. 标本采集和处理

在患儿入院2 d内以负压吸引法吸取下呼吸道吸出物(nasopharyngeal aspirates,NPAs),标本采集后放入含有2 mL生理盐水(0.9%)无菌试管内。554例患儿中11例同时采集了NPAs、全血和粪便,2例同时采集了NPAs和粪便标本。所有标本均装入无菌容器,3 h内4 ℃送至实验室。

NPAs标本9 500× g离心2 min,弃上清,加入500 μL Eagle's液重新混悬,4 ℃保存备用。粪便标本加入3 mL生理盐水(0.9%),剧烈震荡5 min,9 500× g离心5 min,取上清4 ℃保存备用。全血标本500× g离心5 min,取血清4 ℃保存备用。健康对照组鼻咽拭子标本室温溶化后振荡挤压采样拭子,吸取液体500 μL ,4 ℃保存备用。

2. 核酸抽提

将上述标本各取200 μL ,使用罗氏核酸自动提取仪MagNA Pure LC 2.0进行核酸抽提(Roche公司,瑞士),每200微升标本设置洗脱体积为60 μL ,-70 ℃保存用于后续试验。

3. 实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测HBoV亚型和载量

首先将所有标本的核酸进行HBoV亚型检测。参考文献[4]设计针对HBoV1~4型的引物和探针,将引物和探针送上海博尚生物科技有限公司合成。引物序列见表1:

表1 用于HBoV分型的引物和探针序列

合成后用焦碳酸二乙酯水稀释,引物使用浓度40 μmol/L,探针为20 μmol/L,稀释后-70 ℃保存备用。使用罗氏Light Cycler 480荧光进行PCR扩增(Roche公司,瑞士)。反应体系为20 μL,包括10 μL Premix EX Taq (大连宝生物公司,日本), 0.4 μL上游引物(40 μmol/L), 0.4 μL下游引物(40 μmol/L), 0.8 μL 探针(20 μmol/L), 6.4 μL焦碳酸二乙酯水和 2 μL上述抽提DNA。反应条件为:预变性95 ℃ 30 s, 扩增95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min,40个循环。

上述实验确定为阳性的标本使用上海之江生物科技有限公司的HBoV检测试剂盒进行病毒载量检测。将试剂盒提供的阳性质控品(1×107拷贝/mL)进行倍比稀释,反应条件和反应参数按照试剂盒操作说明进行。每个反应至少选择4个稀释度的质控品同时进行扩增,反应结束后仪器会自动绘制标准曲线并根据该曲线自动计算待检标本中病毒载量。同时,每个反应均加入试剂盒提供的阴性对照、阳性对照和无模板对照。

4. 逆转录PCR检测其他常见12种呼吸道病毒

所有HBoV检测为阳性标本的核酸使用Fermentas公司的ReverAid First Strand cDNA Syn-thesis Kit进行第1链cDNA合成,合成后的DNA使用杭州纽罗西敏公司Seeplex RV12 ACE detection Kit检测其他常见12种呼吸道病毒。按照试剂盒操作说明进行操作,仪器使用AB公司GeneAmp PCR system 9700(ABI,Singapore)扩增仪。检测的12种常见呼吸道病毒为:甲型流感病毒(influenza A,FluA)、乙型流感病毒(influenza B,FluB)、呼吸道合胞病毒A(respiratory syncytial viruses A,RSVA)、呼吸道合胞病毒B(respiratory syncytial viruses B,RSVB)、人类偏肺病毒(human metapneumovirus,HMPV)、人副流感病毒1~3型

(human parainfluenza viruses 1,2 and 3,PIV-1,2,3)、腺病毒(adenovirus,AdV)、鼻病毒(human rhinovirusA/B,HRVA/B)、人冠状病毒229E/NL63(human coronavirus 229E/NL63)和人冠状病毒OC43/HKU1(human coronavirus OC43/HKU1)。

三、疾病严重程度分级

根据文献报道的疾病严重程度分级方法进行分级[ 5]。该方法是以临床症状和血气检查指标进行评分获得疾病严重程度指数(index of severity,IOS),主要临床症状包括憋气、喘息,血气检查包括pH值、血中CO2张力、血中O2张力,还包括是否需要住院、是否需要吸氧、是否需要正压通气。IOS值为0~2归类为一般病例,IOS值为3~5归类为中等严重病例,IOS值为6~7归类为非常严重病例。文献中提到的住院时间长短在本研究中没有使用。

四、统计学方法

实验数据采用美国疾病预防控制中心提供的Epi Info(Version 3.6)统计学软件进行统计,计量数据以中位数(四分位数)表示,采用Kruskal-Wallis H检验、Fisher's精确概率法进行分析, P<0.05为差异具有统计学意义。使用Prism software (Version 5.0, GraPad Software, Inc., San Diego, USA)进行绘图。

结果
一、健康对照组和实验组HBoV载量比较

195份健康儿童鼻咽拭子中检测到HBoV阳性标本5份(2.6%),554份住院患儿NPAs标本中HBoV阳性39份(7.0%)。39份HBoV阳性NPAs标本中,19份(48.7%)检测到至少1种其他呼吸道病毒,依次为RSVA 9例(47.4%),HRV和HMPV各3例(15.6%),FluB 2例(10.5%),PIV1和PIV3各1例(5.3%)。13份粪便标本中6份检测到HBoV DNA,11份血清标本中6份检测到HBoV DNA。所有阳性标本HBoV类型均为HBoV1。

5份健康对照组儿童阳性标本的HBoV载量为[2.70(2.60,6.20)]×103拷贝/mL,39份患儿阳性标本HBoV载量为[5.10(0.48,63.00)]×106拷贝/mL,差异有统计学意义( P<0.05)。见图1:

图1 健康对照者和住院患儿HBoV载量比较

二、不同疾病严重程度住院患儿HBoV载量比较

为更准确地了解HBoV载量和疾病严重程度的关系,将混合感染和单独感染患儿HBoV载量与疾病严重程度进行单独分析。在单独感染中HBoV载量在一般、中等和严重3种程度组间差异无统计学意义[0.50(0.05,4.30)×106、0.12(0.006,2.92)×108、0.76(0.006,3.80)×109拷贝/mL, P>0.05];在混合感染中HBoV载量在一般、中等和严重3种程度组中差异有统计学意义[2.70(0.35,9.30)×105、3.85(3.70,4.00)×106、8.70(6.50,74.00)×106拷贝/mL, P<0.05]。见图2:

图2 住院患儿HBoV载量与疾病严重程度相关性分析

注:a图为单独感染病例组HBoV载量与疾病严重程度的关系;b图为混合感染病例组HBoV载量与疾病严重程度的关系

三、2例新生儿感染HBoV临床特征分析

来自呼吸内科的一例12 d新生儿和来自ICU一例18 d新生儿分别在其NPAs中检测到HBoV1 DNA。12 d新生儿同时采集了粪便标本,18 d新生儿同时采集了血液和粪便标本。12 d新生儿粪便标本HBoV1 DNA阴性,18 d新生儿血液、粪便标本均检测到HBoV1 DNA。2例患儿都是足月儿,因肺炎症状入院治疗。具体临床症状见表2:

表2 2例感染HBoV新生儿临床特征
讨论

越来越多的证据表明HBoV 1型可以导致儿童上呼吸道和下呼吸道感染[ 6, 7, 8]。目前研究多使用PCR或实时荧光定量PCR检测标本中HBoV DNA以确定HBoV是否阳性。Martin等[ 9]对健康托幼机构儿童呼吸道标本进行了追踪研究,结果表明HBoV DNA可以长时间释放出来,提示HBoV可能潜伏在健康儿童体内并在一定的条件下引起疾病。所以确定HBoV感染需要同时对血液标本进行抗体或DNA检测,血液标本核酸阳性提示的病毒血症更能支持HBoV是致病病原[ 10, 11]。本研究中同时采集了11例住院患儿的NPAs、血液和粪便标本,其中8例NPAs HBoV阳性的患儿6例血液和粪便标本同时检测到HBoV1 DNA。这一结果进一步表明了HBoV1可以导致5岁以下儿童下呼吸道感染。

HBoV载量与疾病的临床症状以及疾病严重程度的关系也有个别报道[ 12, 13, 14, 15]。Proenca-Modena等[ 13]研究发现HBoV载量与病毒复制指标HBoV mRNA检出率呈正相关,并且患者伴随腹泻症状,这表明在高滴度HBoV更易引起呼吸道症状。本研究参考其他相关文献,选用1×106拷贝/mL做为HBoV载量的分界线[ 16],可以看到健康对照组的HBoV载量属于低载量组,住院患儿为高载量组,这一结果与Proenca-Modena研究符合。提示我们HBoV导致呼吸道疾病需要一定病毒载量。国内朱利华等[ 14]对儿童急性呼吸道HBoV的载量与临床特征进行了相关性研究,指出单独的HBoV载量并不能反映临床感染的严重程度,但该研究中并没有根据患者临床表现对患者疾病严重程度进行科学分级。王婷等[ 15]对急性喘息性患儿疾病严重程度和病毒载量之间的关系进行了分析,发现在单独感染组患儿临床症状的严重程度与病毒载量呈正相关。在本研究中,选用IOS作为患儿临床症状严重程度分级指标,对HBoV载量与疾病严重程度的关系进行分析,结果表明HBoV单独感染不同疾病程度组中病毒载量差异无统计学意义( P>0.05),而混合感染中一般、中等程度组与严重程度组间差异有统计学意义( P<0.05)。推测因HBoV单独引起的呼吸道感染病例在疾病不同严重程度组病毒载量都很高,导致病毒载量与疾病严重程度相关性不明显,而混合感染中首先由其他有明确致病性的病原体引起呼吸道症状,HBoV的感染可以进一步加重疾病严重程度且随着病毒载量的加大而加重。

目前已有2例报道HBoV单独感染导致重症肺炎,Edner等[ 17]报道了一例4岁严重呼吸衰竭的男童,并排除了其他常见呼吸道细菌和病毒的感染,NPAs检测到高滴度的HBoV,同时患儿血液中检测到HBoV1 IgM抗体。Körner等[ 18]报道了一例8个月龄的患有严重肺炎女童,其标本也是单独检测到HBoV感染。上述结果提示HBoV是可能导致儿童严重呼吸道疾病如肺炎和呼吸衰竭的。本研究报道了1例来自ICU的18 d男婴,其NPAs、血液和粪便标本中同时检测到高滴度HBoV1 DNA,并同时排除了常见的其他呼吸道病毒和细菌感染。这一结果进一步证实了HBoV1可以导致儿童严重肺炎。值得一提的是该患儿同时具有腹泻症状,这与先前一些报道相符合。Kapoor等[ 19]研究HBoV感染机制推测该病毒感染途径与细小病毒科其他病毒类似,首先通过呼吸道侵入,在周围淋巴组织进入血液,可以导致除呼吸道以外的其他症状。该18 d男婴为足月儿,没有基础疾病,因咳嗽、憋气就诊,X线提示为严重肺炎,这表明当该患儿发生HBoV感染后,HBoV可能随血液到达肠道,引起腹泻症状。

随着对HBoV研究的逐步深入,HBoV1在儿童呼吸道感染中的作用越来越受到重视。体外培养的成功将促进对其致病机制的进一步研究[ 20]。本研究结果进一步证实了HBoV是儿童呼吸道致病病原,其潜伏在健康儿童呼吸道,引起感染需要突破一定病毒载量。在其他呼吸道致病病原导致呼吸道症状的情况下,HBoV的病毒载量与疾病严重程度呈正相关。HBoV在某些患儿中可以导致严重肺炎病例,需要在今后重症呼吸道感染患儿中加强HBoV检测。另外本研究虽进行了血液中HBoV1 DNA的检测,但未进行HBoV血清抗体的检测,将在后续试验中进行完成和补充。

The authors have declared that no competing interests exist.

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