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王玉月, 史伟峰, 周军. 广泛耐药鲍曼不动杆菌氨基糖苷类药物获得性耐药基因研究. 2013, 28(11): 1008-1011[WANG Yuyue, SHI Weifeng, ZHOU Jun. The study of acquired resistant genes against aminoglycosides in extensively drug-resistantAcinetobacterbaumannii . 上海检验医学, 2013, 28(11): 1008-1011]  
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广泛耐药鲍曼不动杆菌氨基糖苷类药物获得性耐药基因研究
王玉月, 史伟峰, 周军
苏州大学附属第三医院检验科,江苏 常州 213003

王玉月,女,1971年生,学士,副主任技师,主要从事临床微生物检验与细菌耐药基因研究。

摘要
目的

了解重症监护病房(ICU)患者分离的广泛耐药(XDR)-鲍曼不动杆菌(AB)对氨基糖苷类药物获得性耐药基因情况。

方法

用phoenixTM-100全自动细菌鉴定药物敏感性分析仪对AB进行细菌鉴定和药物敏感性试验,gyrA和parC基因扩增测序确定AB。聚合酶链反应(PCR)测定20株XDR-AB的10种氨基糖苷类修饰酶基因、6种16S rRNA甲基化酶基因和外排泵adeB基因,并用DNA测序比对。

结果

20株XDR-AB中,氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)-Ⅰ、aac(6')-Ⅰb、ant(3″)-Ⅰ、aph(3')-Ⅰ检出率分别为90.0%、30.0%、95.0%、95.0%,而aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰad、aac(6')-Ⅱ、ant(2″)-Ⅰ、ant(4')-Ⅰ及aph(3')-Ⅵa基因均未检出。armA型16S rRNA甲基化酶基因和外排泵adeB基因检出率均为100%。

结论

20株XDR-AB均携带了armA和adeB基因,同时aac(3)-Ⅰ、ant(3″)-Ⅰ和aph(3)-Ⅰ检出率较高,提示ICU分离的XDR-AB对氨基糖苷类药物高水平耐药可能与携带的耐药基因有关。

关键词: 广泛耐药鲍曼不动杆菌; 氨基糖苷类修饰酶; 获得性耐药基因; 序列分析
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)11-1008-04
The study of acquired resistant genes against aminoglycosides in extensively drug-resistantAcinetobacterbaumannii
WANG Yuyue, SHI Weifeng, ZHOU Jun
Department of Clinical Laboratory, the Third Affiliated Hospital of Soochow University,Jiangsu Changzhou 213003,China
Abstract
Objective

To investigate the situation of acquired resistant genes against aminoglycosides in extensively drug-resistant (XDR)Acintobacterbaumannii (AB) isolated from intensive care unit (ICU) patients.

Methods

Bacterial identification and susceptibility tests of AB were performed by phoenixTM-100 automatic bacterial identification and susceptibility analyzer, and the AB identification was confirmed bygyrA andparC gene amplification sequencing. For the 20 isolates of XDR-AB, 10 aminoglycoside modifying enzyme genes, 6 16S rRNA methylase genes and efflux pumpadeB genes were detected by polymerase chain reaction(PCR) and verified and compared by DNA sequencing.

Results

Of the 20 isolates of XDR-AB, the detection rates ofaac(3)-Ⅰ,aac(6')-Ⅰb,ant(3″)-Ⅰ andaph(3')-Ⅰ genes were 90.0%,30.0%,95.0% and 95.0%,respectively.However,aac(3)-Ⅱ,aac(6')-Ⅰad,aac(6')-Ⅱ,ant(2″)-Ⅰ,ant(4')-Ⅰandaph(3')-Ⅵa genes were not found.In addition,the armA 16S rRNA methylase gene and efflux pumpadeB genes existed in all of the 20 isolates, and the detection rates were 100%.

Conclusions

All of the 20 isolates of XDR-AB carry not onlyarmA andadeB genes but also a large amount ofaac(3)-Ⅰ,ant(3″)-Ⅰandaph(3)-Ⅰgenes.It indicates that the high-level resistance to aminoglycosides in XDR-AB isolated from ICU may be associated with the resistant genes.

Keyword: Extensively drug-resistantAcintobacter baumannii; Aminoglycoside modifying enzyme; Acquired resistant gene; Sequencing analysis
引言

鲍曼不动杆菌( Acintobacter baumannii, AB)是医院感染的主要病原菌之一,而广泛耐药(extensively drug-resistant, XDR)-AB更是重症监护病房(intensive care unit, ICU)中引起医院感染爆发和流行的主要条件致病菌,给临床治疗带来极大的困难[ 1]。近年来,由于抗菌药物的广泛使用和不合理使用,导致氨基糖苷类药物耐药性愈来愈强。为进一步了解XDR-AB氨基糖苷类药物获得性耐药基因的存在情况,我们检测了20株XDR-AB的10种氨基糖苷类修饰酶基因、6种16S rRNA甲基化酶基因以及外排泵基因。

材料和方法
一、菌株来源

20株菌株均分离自2011年5至8月苏州大学附属第三医院ICU患者的痰液标本。

二、菌种鉴定及药物敏感性试验

细菌鉴定采用美国BD公司生产的phoenixTM-100全自动细菌鉴定药物敏感性分析仪做初筛, 由于生化鉴定法无法区分AB和醋酸钙不动杆菌, 故本组菌株进一步做 gyrA和 parC基因扩增测序( gyrA引物P1:5'-AAATCTGCCCGTGTCGTTGGT-3'; P2:5'-GCCATACCTACGGCGATACC-3'。 parC引物P1:5'-AAACCTGTTCAGCGCCGCATT-3';P2:5'-AAAGTTGTCTTGCCATTCACT-3'。 gyrA和 parC基因引物序列由无锡新区虎马生物信息学工作室提供),测得序列经上网(www.ncbi.nlm.nih.gov)BLASTn比对进一步确认为AB。菌种鉴定以分子鉴定为准。药物敏感性试验在phoenixTM-100全自动细菌鉴定药物敏感性分析仪上进行,抗菌药物敏感性判断根据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) 2011年的判断标准进行。由于国内外报道者对XDR的定义不尽相同,为此本研究综合文献[2, 3]定义XDR菌株,必须是对包括碳青霉烯类在内常用头孢类药物、氨基糖苷类药物、氟喹诺酮类药物均耐药且仅多黏菌素敏感的菌株,方作为被研究对象。

三、细菌基因检测模板制备

挑取经纯培养的单个菌落,置入0.5 mL的Eppendorf离心管(内已事先预置新鲜配制浓度为200 ng/mL的蛋白酶K溶液400 μL), 放置56 ℃水浴2 h(消化细菌细胞膜裸露DNA),然后改放置95 ℃水浴10 min(灭活蛋白酶K)。放置-20 ℃冰箱保存备用。

四、基因检测

10种氨基糖苷类修饰酶基因和6种16S rRNA甲基化酶基因以及外排泵 adeB基因检测均采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)。检测试剂盒以及阳性对照DNA均由无锡市克隆遗传技术研究所提供,完全按照试剂盒说明书操作。全部PCR引物由无锡新区虎马生物信息学工作室设计并获授权使用。靶基因引物识别序列和目的产物长度见表1:

表1 靶基因引物识别序列和目的产物长度

五、DNA测序及比对

β-内酰胺酶基因阳性者均进一步做荧光法测序以确认亚型(委托上海铂尚生物技术有限公司在美国ABI公司的3730型毛细管全自动测序仪上进行)。读序工具软件为Chromas,测序结果用Chromas直接做BLAST Search比对。

结果
一、药物敏感性试验

20株AB除对多黏菌素敏感外,对碳青霉烯类在内的常用头孢类药物、氨基糖苷类药物、氟喹诺酮类药物均耐药。见表2:

表2 20株XDR-AB药物敏感性试验结果[株(%)]

二、氨基糖苷类药物获得性耐药基因检测

20株XDR-AB经10种氨基糖苷类修饰酶基因和6种16S rRNA甲基化酶基因以及外排泵 adeB基因检测, 分别检出 aac(3) -Ⅰ、 aac(6 ') -Ⅰb、 ant(3 ″) -Ⅰ、 aph(3) -Ⅰ等4种氨基糖苷类修饰酶基因, armA 16S rRNA甲基化酶基因以及外排泵 adeB基因, 检出率见表3:

表3 20株XDR-AB氨基糖苷类药物获得性耐药基因检测结果

其余基因均未检出。图1为 aac(6 ') -Ⅰb阳性基因测序图:

图1 aac(6 ') -Ⅰb基因测序图

讨论

氨基糖苷类药物是由微生物产生的一类具抗菌活性的天然化合物,而阿米卡星、异帕米星却为天然化合物的半合成衍生物。近年来,对氨基糖苷类药物的耐药性愈来愈强,与该类药物的滥用直接相关[ 4]。特别是XDR-AB的大量出现,人类已面临无药可用的尴尬境地。本研究从ICU分离的20株AB除对多黏菌素敏感外,对碳青霉烯类在内的常用头孢类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类等均出现耐药。但多黏菌素对肾脏的损害较多见,并不适合XDR-AB治疗。目前可首选头孢哌酮-舒巴坦与米诺环素联合或头孢哌酮-舒巴坦与替加环素联合治疗XDR-AB重症感染[ 5, 6]。

AB对抗菌药物的耐药机制主要有:产氨基糖苷类修饰酶使进入细菌胞内的药物失去生物活性;基因突变致细菌膜通透性降低导致药物摄入量减少[ 7, 8, 9];细菌主动外排机制增强;细菌产16S rRNA甲基化酶, 使其甲基化而导致与药物亲和力下降;细菌16S rRNA或小核糖体蛋白编码基因突变,药物无法与突变的靶位结合[ 7, 9, 10, 11]。产氨基糖苷类修饰酶和产16S rRNA甲基化酶基因可经质粒、整合子等移动遗传元件介导,可在同种或异种细菌间转移,为获得性耐药。而细菌膜通透性改变、16S rRNA编码基因突变及外排机制增强突变均为细菌的看家基因突变,为固有耐药,在细菌中只能垂直传播。AdeABC是AB中重要的外排泵系统,比较基因组学研究发现,多药耐药的AB(AYE株)存在AdeABC外排泵系统, 而敏感株(SDF株)则不存在该系统[ 12]。AdeABC外排泵系统可外排氨基糖苷类药物以及其他药物, adeB基因则编码外排泵蛋白AdeB。

本研究检测20株XDR-AB的10种氨基糖苷类修饰酶基因、6种16S rRNA甲基化酶基因以及外排泵 adeB基因,每株XDR-AB均携带了 armA型16S rRNA甲基化酶基因和外排泵 adeB基因。同时发现氨基糖苷类修饰酶基因检出率也较高, ant(3 ″) -Ⅰ和 aph(3) -Ⅰ均为95 .0 %, 而 aac(3) -Ⅰ、 aac(6 ') -Ⅰb分别为90.0%和30.0%。可见本组XDR-AB对氨基糖苷类药物耐药可能与氨基糖苷类修饰酶、16S rRNA甲基化酶和AdeABC外排泵系统相关。因此应定期监测XDR-AB流行趋势,加强细菌耐药机制研究,为控制医院感染、科学合理地使用抗菌药物提供依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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