引用本文
杨海慧, 韩立中, 刘怡菁, 陈旭, 应春妹, 赵贝棣, 祝燕萍, 卫颖珏. 亚胺培南联合多黏菌素B对不同表型铜绿假单胞菌体外抗菌活性的研究. 2013, 28(1): 1-6
YANG Haihui, HAN Lizhong, LIU Yijing, CHEN Xu, YING Chunmei, ZHAO Beidi, ZHU Yanping, WEI Yingjue. Study on in vitro antibacterial activity of the combined therapy of imipenem with polymyxin B againstPseudomonas aeruginosa with different phenotypes . Labratory Medicine, 2013, 28(1): 1-6  
Permissions
Copyright©2013, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部版权所有
亚胺培南联合多黏菌素B对不同表型铜绿假单胞菌体外抗菌活性的研究
杨海慧1, 韩立中2, 刘怡菁1, 陈旭2, 应春妹1, 赵贝棣1, 祝燕萍1, 卫颖珏1
1.上海交通大学医学院附属仁济医院检验科,上海 200001
2.上海交通大学医学院附属瑞金医院临床微生物科,上海 200025

杨海慧,女,1974年生,学士,主管技师,主要从事病原微生物检测工作。

摘要
目的

探讨多黏菌素B与亚胺培南联用对不同耐药表型铜绿假单胞菌的体外抗菌活性。

方法

自仁济医院西部及瑞金医院临床标本中分离铜绿假单胞菌133株,运用纸片扩散(K-B)法分析其耐药表型,采用琼脂稀释法检测亚胺培南和多黏菌素B单用及联用时对不同表型铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC),计算部分抑菌浓度(FIC),判断联合效应。分别探讨2个不同的配比浓度,即亚胺培南∶多黏菌素B为1∶0.5和1∶1时的抗菌效果。

结果

对2种药物组合进行Kappa一致性检验,药物敏感性结果一致性微弱。亚胺培南与多黏菌素B以1∶1联用时协同率为51.13%,明显高于1∶0.5时的19.55%。运用Fisher's精确概率法分析不同表型间的联合抑菌效应,亚胺培南与多黏菌素B以1∶1浓度配比时,对各表型间均有较高的协同率,不存在明显的统计学差异;而1∶0.5时差异明显。

结论

体外联合应用亚胺培南与多黏菌素B对铜绿假单胞菌的抗菌效果明显优于单用亚胺培南。以1∶1联用时的协同率优于1∶0.5,且对不同耐药表型的铜绿假单胞菌作用稳定,值得向临床推广。

关键词: 铜绿假单胞菌; 联合用药; 耐药; 亚胺培南; 多黏菌素B
中图分类号:R378.99 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)01-0001-06
Study on in vitro antibacterial activity of the combined therapy of imipenem with polymyxin B againstPseudomonas aeruginosa with different phenotypes
YANG Haihui1, HAN Lizhong2, LIU Yijing1, CHEN Xu2, YING Chunmei1, ZHAO Beidi1, ZHU Yanping1, WEI Yingjue1
1. Department of Clinical Laboratory, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200001,China
2.Department of Clinical Microbiology, Ruijin Hospital ,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025,China
Abstract
Objective

To investigate the in vitro antibacterial activity of the combined therapy of imipenem with polymyxin B againstPseudomonas aeruginosa with different phenotypes.

Methods

A total of 133 clinically isolatedPseudomonas aeruginosa were collected from Renji Hospital (West Department) and Ruijin Hospital, and the phenotypes were determined by disc diffusion (K-B) method. The minimum inhibitory concentrations (MIC) of imipenem, polymyxin B and imipenem with polymyxin B againstPseudomonas aeruginosa were calculated by agar dilution method, and the fractional inhibitory concentrations (FIC) were calculated. The combined effect was analyzed. There were 2 ratios, 1∶0.5 and 1∶1 with imipenem to polymyxin B.

Results

The drug sensitivities of those 2 therapies turned out to be inconsistent when conductingKappa test. The synergistic rate of 1∶1 with imipenem to polymyxin B was 51.13%, which was much higher than 1∶0.5 with imipenem to polymyxin (19.55%). Fisher's exact test demonstrated that 1∶1 with imipenem to polymyxin B maintained high synergistic rate between different phenotypes, and there was no statistically significant difference. However, the difference was significant regarding to 1∶0.5 with imipenem to polymyxin B.

Conclusions

Comparing with monotherapy, the combined therapy of imipenem with polymyxin B significantly increases the sensitivity ofPseudomonas aeruginosa in vitro. The combined therapy applying 1∶1 with imipenem to polymyxin B with a higher synergistic rate than that applying 1∶0.5 with imipenem to polymyxin B and a good stability may be a good choice for the antibiotics resistantPseudomonas aeruginosa with different phenotypes.

Keyword: Pseudomonas aeruginosa; Drug combination; Resistance; Imipenem; Polymyxin B
引言

铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa)是医院内获得性感染最重要的条件致病菌之一,其耐药机制复杂,对多种临床常用抗菌药物呈现明显的固有和获得性耐药。以亚胺培南和美罗培南为代表的碳青霉烯类抗菌药物具有广谱、高效的抗菌活性,是临床治疗铜绿假单胞菌感染的主要抗菌药物。近年来,随着亚胺培南在临床上的广泛使用,铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类抗菌药物的报道日益增多。多黏菌素具有强大的抑菌作用,且不易产生耐药性,是20世纪60年代常用的治疗革兰阴性菌,特别是铜绿假单胞菌感染的抗菌药物,但多黏菌素因其较显著的肾毒性和神经毒性,随着一些替代性新药物的出现,20世纪80年代以来几近被弃用。然而,目前多药耐药铜绿假单胞菌感染的增多,促使多黏菌素类药物作为治疗的最后选择又被应用于临床。我们以亚胺培南、多黏菌素B单用方案为对照,拟探讨亚胺培南和多黏菌素B 2种药物联用方案对不同耐药表型的铜绿假单胞菌的体外抗菌效果,为临床最佳治疗方案的选择提供依据。

材料和方法
一、材料

1.菌株

收集2010年11月至2011年1月仁济医院和瑞金医院临床标本中分离检出的铜绿假单胞菌共133株(剔除同一患者同一部位重复分离株),标本主要包括痰液、分泌物、尿液、血液及引流液等。经常规方法、VITEK 32全自动微生物鉴定系统鉴定到种。质控株为铜绿假单胞菌(ATCC 27853)、大肠埃希菌(ATCC 25922),购自上海市临床检验中心。

2.试剂

注射用亚胺培南/西司他丁钠(500 mg/500 mg,杭州默沙东制药有限公司);硫酸多黏菌素B(50 mg/50万单位,美国Sigma公司);药物敏感性纸片为替卡西林(75 μg)、替卡西林-克拉维酸[(75 + 10)μg]、头孢噻肟(30 μg)、头孢吡肟(30 μg)、头孢他啶(30 μg)、氨曲南(30 μg)、亚胺培南(10 μg)和多黏菌素B(30μg)等(英国Oxoid公司);Mueller-Hinton琼脂粉(英国Oxoid公司);血琼脂平板、巧克力培养基、麦康凯培养基(法国生物梅里埃公司)。

3.仪器

多点接种器、96孔平板、菌液比浊仪、一次性使用培养皿(江苏康健医疗用品有限公司)、恒温水浴箱、微生物培养箱等。

二、方法

1.纸片扩散(改良Kirby-Bauer agar,K-B)法及铜绿假单胞菌耐药表型的分类

2005年G. Vedel建立了基于K-B法药物敏感性试验结果判断铜绿假单胞菌耐药机制的判读方案,2008年杨海慧等根据国内药物敏感性试验的具体情况改进了铜绿假单胞菌耐药机制的分析方案,且对仁济医院分离的菌株进行了分析,在本次研究中应用该方案对铜绿假单胞菌的耐药机制进行分析,并根据分析结果进行分组[ 1, 2, 3]。表型分类方案简述如下:(1)野生表型,有着天然耐药机制,对于试验使用的抗菌药物敏感,这些抗菌药物的抑菌圈直径均在30 mm左右,多黏菌素在1418 mm左右;(2)“对亚胺培南选择性非渗透性”表型(OprD)和/或MexE-MexF-OprN泵出系统表型(简称OprD/泵出系统表型),对亚胺培南较弱或不敏感,其他与野生表型相似;(3)MexA-MexB-OprM泵出系统(简称ABM)表型,普遍出现对替卡西林和头孢噻肟的敏感性降低。其他β-内酰胺类药物的活性是可变的,但头孢他啶的活性高于氨曲南(头孢他啶的抑菌圈直径>氨曲南的抑菌圈直径);(4)金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamases,MBL)表型,对头孢他啶耐药,氨曲南的活性高于头孢他啶(氨曲南的抑菌圈直径>头孢他啶的抑菌圈直径),由于MBL对碳青霉烯类药物的水解活力很高,所以一般对亚胺培南不敏感;(5) 超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)表型,对替卡西林、头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南、头孢磺啶及所有其他β-内酰胺类药物耐药,但对亚胺培南敏感;(6)ABM+ OprD/泵出系统表型,对亚胺培南活性较低,同时头孢他啶的抑菌圈直径>氨曲南的抑菌圈直径;(7)泛耐药表型,对所有试验抗菌药物(除多黏菌素)均耐药,同时存在多种耐药机制。

2.联合药物敏感性试验

选择4组药物制备含药水解酪蛋白胨(M-H)琼脂平板进行药物敏感性试验,第1组:亚胺培南(1280.03 μg/mL);第2组:亚胺培南与多黏菌素B 1∶1(1280.03 μg/mL);第3组:亚胺培南与多黏菌素B 1∶0.5;第4组:多黏菌素(1280.03 μg/mL)。配制0.5麦氏的菌悬液(用1 mL生理盐水配制),并进行1∶10稀释(0.1 mL菌液加入0.9 mL生理盐水)。将稀释好的菌液注入96孔的微孔板中,每孔100 μL。使用多点接种器(60支接种棒)蘸取微孔板中的菌液,点种于各块含药M-H琼脂平板,最终菌量约为每个接种点104个细菌。将接种后的平板置于35 ℃培养箱中孵育24 h后观察结果,以完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为相应药物对该菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。

3.联合效应判断

根据部分抑菌浓度(fractional inhibitory concentration,FIC)判断联合用药的效果。FIC 值的计算:FIC=MIC甲乙药联用/MIC甲药单用+MIC甲乙药联用/MIC乙药单用, (1)FIC≤0.5,表示2种药联用有协同作用,即抗菌活性显著大于各单药抗菌作用之和;(2)0.5<FIC≤1,2种药有累加作用,即抗菌活性较任一种单药稍有增加;(3)1<FIC≤2,2种药有无关作用,即抗菌活性均不受另一种药物的影响;(4)FIC>2,2种药有拮抗作用,即其中一种抗菌药物的活性被另一种抗菌药物削弱[ 4]。

三、统计学方法

细菌耐药情况采用世界卫生组织(WHO)细菌耐药监测网提供的WHONET 5.3统计软件分析,方法学比较采用SPSS 17.0软件进行 Kappa一致性检验和Fisher's精确概率法检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

一、耐药表型分析

2010年11月至2011年1月自仁济医院和瑞金医院收集的铜绿假单胞菌共133株。通过K-B法分析其耐药表型,结果显示野生表型的铜绿假单胞菌占37.59%(50/133),OprD/泵出系统表型占27.82%(37/133),ABM表型占15.79%(21/133),ESBLs表型占12.03%(16/133),泛耐药表型占12.03%(9/133)。

二、联合药物敏感性分析

1.亚胺培南和多黏菌素B单用和联用的MIC值

使用琼脂对倍稀释法检测4种药物配比浓度下的MIC值,见 表1。联合用药组的MIC值均低于单用亚胺培南组,且1∶1联合组的MIC值均低于1∶0.5组,其MIC90及MIC50较多黏菌素B组也有所下降。从中可以直观地看到,1∶1联合组抑菌效果可能较好。

表1 亚胺培南与多黏菌素B单用和联用对铜绿假单胞菌的MIC(μg/mL,133例)

2. 2种药物组合下抑菌效应的比较

根据各组抗菌药物的MIC值及配比浓度计算FIC值,判断联合效应。不同配比浓度下,亚胺培南和多黏菌素B的联合抑菌效应见 表2。对2种药物组合进行 Kappa一致性检验,得 Kappa系数( K)=0.062,根据Landis等[ 4]的判断标准,亚胺培南∶多黏菌素B=1∶1和亚胺培南∶多黏菌素B=1∶0.5时对铜绿假单胞菌的药物敏感性结果一致性微弱,即存在显著差异。通过计算发现,亚胺培南∶多黏菌素B=1∶1时协同率为51.13%;亚胺培南∶多黏菌素B=1∶0.5时协同率为19.55%,可见药物配比浓度亚胺培南:多黏菌素B=1∶1时,2种药联用协同率更高。

表2 2种药物组合下联合抑菌效应的比较

3. 2种药物组合对不同表型铜绿假单胞菌的抑菌效应

将铜绿假单胞菌按耐药表型分组,分别计算不同抗菌药物配比浓度下对不同表型铜绿假单胞菌的联合抑菌效应。 图1和 图2显示了2种药物组合对不同表型铜绿假单胞菌的抑菌效应(以百分比表示)。由图可见,亚胺培南和多黏菌素B联用后,对各表型铜绿假单胞菌的抑菌效应可能存在差异,但主要还是以协同和相加效应为主,拮抗作用较罕见。

图1 亚胺培南∶多黏菌素B =1∶0.5对铜绿假单胞菌各表型的联合效应

图2 亚胺培南∶多黏菌素B =1∶1对铜绿假单胞菌各表型的联合效应

4.各表型间联合效应的比较

鉴于联合用药的目的之一就是要获得2种抗菌药物的协同作用,从而能减少用量、降低毒副反应、减少耐药性的产生等。因此本研究将亚胺培南和多黏菌素B联用时对铜绿假单胞菌的抑菌效应进行分类,相加、无关、拮抗为一组,称之为非协同组;产生协同作用的全归于协同组。 表3是亚胺培南∶多黏菌素B=1∶1时各表型间联合抑菌效应列联表。利用SPSS 17.0软件对其进行Fisher's精确概率法检验,结果显示差异无统计学意义( P>0.05)。说明当亚胺培南与多黏菌素B以1∶1浓度配比时,对各表型铜绿假单胞菌均有较高的协同作用,各表型间协同率不存在明显的统计学差异。同样将亚胺培南∶多黏菌素B=1∶0.5时各表型间联合抑菌效应列成 表4,Fisher's精确概率法检验的输出结果显示差异有统计学意义( P<0.01)。即亚胺培南与多黏菌素B以1∶0.5浓度联合用药时,对各表型铜绿假单胞菌的抑菌效果存在差异,可能对某些表型铜绿假单胞菌较为敏感,而对于另一些表型的铜绿假单胞菌却达不到预期效果。这种联合配方对不同耐药机制的铜绿假单胞菌作用不一致,极易导致临床疗效不稳定。

表3 亚胺培南∶多黏菌素B =1∶1时各表型间联合抑菌效应
表4 亚胺培南∶多黏菌素B =1∶0.5时各表型间联合抑菌效应
讨论

铜绿假单胞菌是医院内感染最常见最重要的病原菌之一。以亚胺培南和美罗培南为代表的碳青霉烯类抗菌药物具有广谱、高效的抗菌活性,由于其对多数β-内酰胺酶稳定,与第3代头孢菌素无交叉耐药性,MIC和最低杀菌浓度(MBC)非常接近等,在临床上成为治疗铜绿假单胞菌感染的主要抗菌药物。但是近年来随着亚胺培南在临床上的广泛使用,在治疗产生的选择性压力下,铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类抗菌药物的报道日益增多。哥伦比亚一家有着195张床位的三级医疗中心分离出的铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率从1996年的2%和1997年的28%升至2003年的逾40%[ 5]。法国一项研究选取全国13家教学医院收集到的735株铜绿假单胞菌(其中70株采自有囊肿纤维化感染的患者),对亚胺培南的耐药率达30%[ 6]。据中国医院感染监控网(chinese nosocomial infection surveillance system,CNISS)的数据分析,耐亚胺培南铜绿假单胞菌的检出率从1999年7月至2001年6月的23.57%上升到2005年7月至2007年6月的33.15%。2007年中国CHINET细菌耐药性监测统计数据中,铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率已达36%。已有多篇报道证实碳青霉烯类抗菌药物的耐药与其使用量呈明显正相关[ 7, 8, 9],这提示临床不能过分依赖亚胺培南作为治疗铜绿假单胞菌的经验性选择药物,以防多重耐药甚至泛耐药株的蔓延和爆发。

本研究通过K-B法药物敏感性分析发现,有2种以上耐药表型同时存在的复杂型占所有研究菌株的20.30%,分别为9株ABM+OprD/泵出系统表型、16株泛耐药表型以及2株MBL+ OprD/泵出系统表型。按先前的定义,他们均可以归于多重耐药的范畴。所有这些复杂表型对亚胺培南全部耐药,其中OprD表型在复杂表型中占了极大的比例。这次结果再一次证实了,多重耐药铜绿假单胞菌株与碳青霉烯类抗菌药物所诱导的耐药性密不可分,甚至还会导致泛耐药株的出现,往往使临床治疗束手无策。令人担忧的是,使用美国临床实验标准化协会(CLSI)推荐的标准药物敏感性试验——K-B法测得133株铜绿假单胞菌中,对亚胺培南的不敏感率高达32.33%。怎样控制耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的涌现及寻找最佳对策是目前的当务之急。

多黏菌素在20世纪60年代是常用的治疗革兰阴性菌,特别是铜绿假单胞菌感染的抗菌药物,具有强大的抑菌作用,且不易产生耐药性。其是一种快速杀菌剂,主要作用于细菌细胞膜,使胞内重要物质外漏影响核质和核糖体功能,临床常用的有多黏菌素B及多黏菌素E。但从20世纪80年代以来,多黏菌素因其较显著的肾毒性和神经毒性以及一些替代性新药物的出现,几近被弃用。然而,目前多药耐药革兰阴性菌感染的增多,促使多黏菌素类作为治疗的最后选择又被应用于临床,CLSI也着手制定质控范围。目前多数主张对多重耐药或泛耐药革兰阴性杆菌感染,采用多黏菌素类与其他药物的联合治疗[ 10],多重耐药株的出现及流行更是证明了单药治疗的局限性。在许多实验和临床研究中,联合应用多黏菌素在难治性感染中的治疗效果已经得到肯定[ 11, 12, 13]。本次研究选用多黏菌素B与亚胺培南对不同耐药表型的铜绿假单胞菌进行体外联合药物敏感性研究,以期为临床合理用药提供试验依据。结果显示,当亚胺培南与多黏菌素B联合应用时,对铜绿假单胞菌的抑制作用明显增强,主要表现为协同和相加。但抑菌效应可能与药物的配比浓度有关,因为对2种药物组合进行 Kappa一致性检验,发现亚胺培南∶多黏菌素B =1∶1和亚胺培南∶多黏菌素B =1∶0.5时对铜绿假单胞菌的药物敏感性结果一致性微弱,存在显著差异。即不同的药物组合比例对铜绿假单胞菌的联合抑菌效应不尽相同。实验数据表明,亚胺培南与多黏菌素B以1∶1联用时协同率为51.13%,明显高于1∶0.5时的19.55%。同时,对不同表型的铜绿假单胞菌的联合抑菌效应进行Fisher's精确概率法分析,亚胺培南与多黏菌素B以1∶1浓度配比时,对各表型间协同率不存在明显的统计学差异,均有较高的协同作用。而亚胺培南与多黏菌素B以1∶0.5浓度联合用药时,对各表型铜绿假单胞菌的抗菌效果不一致,差异有统计学意义。亚胺培南∶多黏菌素B =1∶0.5可能对某些表型铜绿假单胞菌较为敏感,而对于另一些表型的铜绿假单胞菌却达不到预期效果。这种联合配方对不同耐药机制的铜绿假单胞菌作用一致性较差,极易导致临床疗效不稳定的境况,使用时应尤为注意。但本研究设计为单纯的体外试验,而体内环境要比体外复杂得多,该结果是否同时适合于体内的环境仍需进一步探讨。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Vedel G. Simple method to determine beta-lactam resistance phenotypes in Pseudomonas aeruginosa using the disc agar diffusion test[J]. J Antimicrob Chemother, 2005, 56(4): 657-664. [本文引用:1] [JCR: 5.338]
[2] 杨海慧, 赵贝棣, 卫颖珏, 等. 纸片药敏试验对铜绿假单胞菌β-内酰胺类耐药表型的分析[J]. 检验医学, 2008, 23(5): 500-503. [本文引用:1]
[3] ClinicalLaboratory Stand ards Institute. Performance stand ards for antimicrobial susceptibility testing; twentieth informational supplement[S]. M100-S20, CLSI, 2010. [本文引用:1]
[4] Land is JR, Koch GG. The measurement of observer agreement for categorical data[J]. Biometrics, 1977, 33(1): 159-174. [本文引用:2] [JCR: 1.412]
[5] Crespo MP, Woodford N, Sinclair A, et al. Outbreak of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa producing VIM-8, a novel metallo-beta-lactamase, in a tertiary care center in Cali, Colombia[J]. J Clin Micorbiol, 2004, 42(11): 5094-5101. [本文引用:1]
[6] Cavallo JD, Leblanc F, Fabre R. Surveillance of Pseudomonas aeruginosa sensitivity to antibiotics in France and distribution of beta-lactam resistance mechanisms: 1998 GERPB study[J]. Pathol Biol, 2000, 48(5): 472-477. [本文引用:1] [JCR: 1.672]
[7] Troillet N, Samore MH, Carmeli Y, et al. Imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa: risk factors and antibiotic susceptibility patterns[J]. Clin Infect Dis, 1997, 25(5): 1094-1098. [本文引用:1] [JCR: 9.374]
[8] Jaccard C, Troillet N, Harbarth S, et al. Prospective rand omized comparison of imipenem-cilastatin and piperacillin-tazobactam in nosocomial pneumonia or peritonitis[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1998, 42(11): 2966-2972. [本文引用:1]
[9] Carmeli Y, Troillet N, Eliopoulos GM , et al. Emergence of antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa: comparison risks associated with different entipseudomonal agents[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1999, 43(6): 1379-1382. [本文引用:1]
[10] Rahal JJ. Novel antibiotic combinations against infections with almost completely resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter species[J]. Clin Infect Dis, 2006, 43(Suppl 2): S95-S99. [本文引用:1] [JCR: 9.374]
[11] Yoon J, Urban C, Terzian C, et al. In vitro double and triple synergistic activities of polymyxin B, imipenem, and rifampin against multidrug-resistant Acinetobacter baumannii[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(3): 753-757. [本文引用:1]
[12] Petrosillo N, Chinello P, Proietti MF, et al. Combined colistin and rifampicin therapy for carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii infections: clinical outcome and adverse events[J]. Clin Microbiol Infect, 2005, 11(8): 682-683. [本文引用:1] [JCR: 4.578]
[13] 罗燕萍, 王雪英, 沈定霞, 等. 多黏菌素B与美罗培南对110株多药耐药鲍氏不动杆菌联合药敏研究[J]. 中华医院感染学杂志, 2008, 18(9): 1312-1314. [本文引用:1]