引用本文
卿克勤, 韩敏, 乐军. 结核分枝杆菌噬菌体快速检测方法的临床应用评价. 2012, 27(9): 760-763
QING Keqin, HAN Min, YUE Jun. Clinical application evaluation of the FAST plaque TB assay for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis . Labratory Medicine, 2012, 27(9): 760-763  
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结核分枝杆菌噬菌体快速检测方法的临床应用评价
卿克勤1, 韩敏2, 乐军2
1. 成都市第一人民医院,成都 610016
2. 同济大学附属上海市肺科医院,上海 200433

作者简介:卿克勤,男,1966年生,副主任技师,主要研究方向临床疾病快速诊断。

摘要
目的

评价噬菌体生物扩增法直接检测痰样本中结核分枝杆菌的临床效果。

方法

应用噬菌体生物扩增法、金胺O染色涂片镜检和快速培养法对530例临床痰样本进行检测。结果以快速培养法培养结果为参考标准进行评价。

结果

530例痰样本中有270例快速培养法阳性,其中噬菌体生物扩增法有220例阳性,而260例快速培养法阴性的样本中有20例噬菌体生物扩增法阳性;噬菌体生物扩增法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为81.6%、92.3%、91.6%、82.8%。涂片联合噬菌体生物扩增法的检测敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为88.9%、80.8%、82.8%和87.5%。

结论

噬菌体生物扩增法具有较高的敏感性和特异性,以及快速、安全等优点,特别是对于痰涂片阴性的结核病患者具有较高的临床应用价值。

关键词: 结核分枝杆菌; 噬菌体; 快速培养法
中图分类号:R378.91 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)09-0760-04
Clinical application evaluation of the FAST plaque TB assay for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis
QING Keqin1, HAN Min2, YUE Jun2
1. Chengdu First People's Hospital, Sichuan Chengdu 610016,China
2. Shanghai Pulmonary Hospital,Tongji University, Shanghai 200433,China
Abstract
Objective

To evaluate the efficacy of FAST plaque TB assay for the direct detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens.

Methods

A total of 530 sputum specimens were detected by FAST plaque TB assay, auramine O stain smear microscopy and a rapid culture assay.

Results

of a rapid culture assay were as the reference standards for evaluation.

Results

Of the 530 sputum samples, there were 270 sputum samples positive by the rapid culture assay, including FAST plaque TB assay detected 220 positive. In the 260 negative sputum samples by the rapid culture assay, there were 20 positive by FAST plaque TB assay. The sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of FAST plaque TB assay were 81.6%, 92.3%,91.6% and 82.8%.The sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of the combined determination of FAST plaque TB assay and smear microscopy were 88.9%,80.8%,82.8% and 87.5%.

Conclusions

FAST plaque TB assay has certain high sensitivity and specificity , as well as fast, safe and other advantages. The assay shows a high clinical significance especially for smear-negative tuberculosis patients.

Keyword: Mycobacterium tuberculosis; Bacteriophage; Rapid culture assay

结核病细菌学检查是临床诊断结核病的重要依据, 也是考核和评价疗效的重要指标。然而, 目前常用的实验室诊断技术都存在明显的缺陷: 涂片显微镜检查虽快速、价廉, 但不能区分活菌和死菌, 且检出率偏低, 无法满足临床要求; 传统的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)分离培养方法-改良罗氏培养虽然检出率较高, 但耗时较长, 阴性结果报告需要8周; 采用BACTEC MGIT 960、BacT/ALERT 3D 等仪器培养方法较为快速, 但阳性样本平均也需要8 d, 而且仪器昂贵, 试剂依赖进口; 新兴的分子生物学技术, 包括实时定量聚合酶链反应(PCR)技术、基因芯片技术等, 价格高昂, 技术难度大, 无法广泛推广[1]。临床迫切需要一种快速、可靠、廉价的实验室诊断方法。

噬菌体生物扩增法[2, 3]的基本原理是用特异性分枝杆菌噬菌体D29作为指示剂检测临床样本中存活的MTB。MTB特异的分枝杆菌噬菌体(ActiphageTM)只能感染活的MTB, 如待检样本中含有MTB活菌, 噬菌体便与之结合并侵入菌体内。未感染MTB的噬菌体被随后加入的杀毒剂所灭活, 已进入MTB内的噬菌体则受到保护, 在菌体内大量繁殖, 直至菌体裂解, 培养皿上出现嗜菌斑; 如待检样本中不含MTB, 噬菌体随即被杀毒剂清除, 培养皿上就无嗜菌斑出现[2]。我们以BACTEC MGIT 960检测仪培养结果为参考标准, 评价噬菌体生物扩增法在检测临床样本中MTB的可行性和实用性。

材料和方法
一、实验样本

530 例痰样本取自上海市肺科医院临床确诊的肺结核住院患者, 其中男318 例、女212 例, 年龄20~68岁。

二、仪器和试剂

ACTEC MGIT 960自动培养仪(美国BD公司); 噬菌体生物扩增法(FAST Plaque TBTM )试剂盒由英国BIOTEC Lab公司生产。

二、方法

1. 噬菌体生物扩增法 严格按试剂盒说明书操作。18~24 h 后判读结果, 每次检测要同时设阳性对照和阴性对照平皿。判定标准:阴性结果≤ 19个噬菌斑, 阳性结果≥ 20个噬菌斑。

2. 快速培养法 530份痰样本均用BACTEC MGIT 960自动培养仪检测, 严格按仪器使用说明书进行操作。培养6周后还未报阳性, 结果判定培养阴性。培养阳性的样本再用抗酸染色法和对硝基苯甲酸(P-NBA)测定确定。

3. 涂片镜检 所有痰样本均使用金胺O染色, 荧光显微镜镜检。所有的结果观察均由同一位有经验的检验技术人员完成。荧光显微镜观察到分枝杆菌数目≥ “ ± ” , 即为涂片阳性。荧光显微镜镜检阳性标准参见《结核病诊断实验室检验规程》[2]。

三、统计学方法

采用SPSS 10.0 统计软件分析。以快速培养法结果为参考标准对噬菌体生物扩增法结果进行评价, 计算敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。计数资料比较采用卡方检验。

结 果
一 、噬菌体生物扩增法和快速培养法比较

530例痰样本中快速培养法和噬菌体生物扩增法阳性例数分别为270例、240例。在270例快速培养法阳性的样本中噬菌体生物扩增法有220例阳性, 检出率为81.5%; 260例快速培养法阴性的样本中噬菌体生物扩增法阳性20例, 检出率7.8%。以快速培养法结果为评价标准, 噬菌体生物扩增法的检测敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为81.6%、92.3%、91.6%、82.8%。见表1。

表1 噬菌体生物扩增法和快速培养法结果比较
二、噬菌体生物扩增法与涂片镜检法比较

530例痰样本中涂片阳性240例(45.4%), 其中200例(33.0%)培养阳性。噬菌体生物扩增法对涂片阳性样本的检测敏感性为90.0%、特异性为75.0%、阳性预测值为94.2%、阴性预测值为60%。涂片阴性290例, 其中70例(24.1%)培养阳性。噬菌体生物扩增法对涂片阴性样本的检测敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为57.1%、91.3%、80.0%和87.5%。见表2、表3。

表2 涂片阳性样本中噬菌体生物扩增法检出结果分析
表3 涂片阴性样本中噬菌体生物扩增法检出结果分析
三、噬菌体生物扩增法和快速培养法不一致样本分析

快速培养法阳性而噬菌体生物扩增法阴性的50例样本中有20例涂片阳性, 其镜检MTB量属于“ ± ” 范围(即MTB含量很低)。对这20例样本的培养液再次使用噬菌体生物扩增法进行检测, 得到阳性结果。另外30例涂片阴性的样本其快速培养法结果鉴定为MTB生长。因此, 这50例样本为噬菌体生物扩增法检测假阴性。

快速培养法阴性而噬菌体生物扩增法阳性的20例(3.8%)样本中有10例涂片阳性、10例涂片阴性。取这20例样本的培养液进行涂片抗酸染色镜检, 未见抗酸杆菌。因此, 这20例样本为噬菌体生物扩增法检测假阳性。

四、噬菌体生物扩增法联合涂片镜检方法与快速培养方法比较

涂片或涂片联合噬菌体生物扩增法检测的结果与培养法进行比较, 涂片检测的敏感性为74.1%、特异性为84.6%、阳性预测值为83.3%、阴性预测值为75.9%; 而涂片联合噬菌体生物扩增法的检测敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为88.9%、80.8%、82.8%和87.5%。见表4。

表4 涂片联合噬菌体生物扩增法检出结果分析
讨 论

结核病的诊断主要依靠临床评价、痰涂片镜检和胸片[4, 5]。但是对于涂片阴性的患者来说, 这些指征与涂阳患者相比特征性不强, 容易漏检。而且, 随着伴发人类免疫缺陷病毒(HIV)的肺结核增加, 导致结核病患者的临床表现不典型, 降低了经典微生物检验方法的敏感性[5, 6]。因此, 尽管临床高度怀疑MTB感染, 但还是造成大量涂片阴性的活动性肺结核漏检。开发一种快速诊断结核病的新技术成为全球共识。噬菌体生物扩增法的快速有效检测MTB对结核病早期发现和早期治疗具有极其重要的临床意义。

FAST Plaque TBTM是一个基于噬菌体扩增技术的结核病商品化检测试剂[10]。国外已有临床应用评估报告, 但国内尚无大规模评价报告。本研究应用噬菌体生物扩增法检测了530份痰样本。方法操作简单, 24 h内便可获得检测结果。与快速培养法相比, 噬菌体生物扩增法检测的敏感性为81.5%、特异性为92.3%, 与Trollip等[7]和Kiraz 等[8]的结果一致。本研究结果表明涂片法检测的敏感性为74.1%, 而涂片联合噬菌体生物扩增法检测MTB, 敏感性可上升到88.9%。说明噬菌体生物扩增法检测可提高活动性结核(涂片或培养阳性结核病)的检出率。

本研究中, 快速培养法阳性而噬菌体生物扩增法阴性的50例痰样本可能是由于痰样本中MTB含量太低导致噬菌体生物扩增法出现假阴性。快速培养法阳性而噬菌体生物扩增法阴性的20例涂片阳性样本中有10例为涂片镜检“ ± ” 、10例为“ +” 。一般来说, 涂片阳性的样本噬菌体生物扩增法通常也为阳性, 造成噬菌体生物扩增法假阳性可能有以下原因:(1)本研究中痰样本消化时用的只是单纯的NaOH溶液, 而且没有经过预培养; 有文献报道, 用N-乙酰-半胱氨酸-NaOH消化痰样本的阳性检出率显著高于单纯用NaOH液化的样本, 而且预培养后的痰样本阳性检出率也明显高于未经培养者[1]; (2)噬菌体生物扩增法需要有活菌和完整的噬菌体受体, 而在痰处理的过程中噬菌体受体有可能会遭到破坏; (3)在某些痰样本中可能存在着抑制噬菌体的物质, 如各种微生物和白细胞释放的蛋白酶抑制剂, 影响了噬菌体与MTB的结合。

本研究530例样本中有20例样本快速培养法阴性而噬菌体生物扩增法阳性, 其中有10例涂片阳性、10例涂片阴性。涂片假阳性有可能是其他微生物的非特异染色所导致的显微镜假象。且本研究使用的是金胺“ O” 染色, 其MTB漏检比例(36%)要低于萋尔-尼尔逊抗酸染色法(38%), 但其导致的假阳性也会增加。假阳性也可能是由于实验室的交叉污染, 特别是痰涂片阳性多的实验室。噬菌体生物扩增法检测的假阳性有可能是高浓度的非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)引起, 但因为此次培养阳性的结果经鉴定均为MTB, 所以此原因的可能性不大。其次有可能是杀毒剂的效力不够。其中有1例噬菌体生物扩增法阳性而快速培养法阴性、涂片阴性的样本的噬菌斑数量为22个, 非常接近临界值(20个)。由于临界值是由生产厂商制定, 所以这例噬菌体生物扩增法阳性结果值得怀疑。

涂片阴性结核病患者的检测是目前临床实验室的研究重点之一。研究表明, 痰涂片阴性的患者也会传染结核病[9]。在国外, 噬菌体生物扩增法已经应用于临床, 都获得了较为理想的结果。Albert等[10]报告了噬菌体生物扩增法对涂片阴性样本的检测敏感性为48.7%、特异性为99.5%; Muzaffar等[11]报告的噬菌体生物扩增法对涂片阴性样本的检测敏感性为67.1%、特异性为98.4%。本研究中噬菌体生物扩增法对涂片阴性样本的敏感性为57.1%、特异性为91.3%。本研究还表明, 当涂片镜检和噬菌体生物扩增法联合用于结核病检测时, 敏感性可提高到88.9%、特异性为80.8%; 即有88.9%的经快速培养法鉴定为MTB的病例可被快速诊断。提示噬菌体生物扩增法可作为涂片阴性结核病患者的诊断方法之一。

本研究表明噬菌体生物扩增法在快速检测痰样本时敏感性和特异性都较高, 而且该方法的技术要求不高, 普通的微生物实验人员经过简单的培训就可操作。由于不需要任何特殊的实验室设备, 该方法可与涂片镜检一起纳入实验室常规检查项目。此外, 该方法在操作上具有很高的安全性, 因为存活的MTB被噬菌体裂解, 相比那些增加活菌数的培养方法更安全。而且噬菌体生物扩增法还可用于HIV高危人群的检测, 由于其检测的是活的分枝杆菌, 而非抗原、抗体, 其结果不受HIV感染的影响。与其他一些快速诊断方法, 如聚合酶链反应(PCR)、生物芯片等相比也具有独特的优越性。此法检测的是MTB活菌, 死菌不会出现噬菌斑, 而抗酸染色、荧光染色和分子生物学方法都不能区分死菌和活菌。该法的重复性好, 检测范围广泛, 并且可根据噬菌斑的多少粗略估计MTB感染的程度[10]。

此外, 噬菌斑的数量与样本中的活菌数呈正相关的关系提示噬菌体生物扩增法可用于MTB药敏检测。国外学者应用该法检测MTB药物敏感性, 并与快速培养药物敏感性和DNA测序法的药敏结果进行比较, 结果证明此法在检测MTB药物敏感性方面具有独特优越性[12]。此外由于该法检测的是活菌, 因此有可能作为评估抗结核疗效的一种手段, 但尚需进一步研究证实其在监测抗结核药物治疗效果中的作用。

综上所述, 噬菌体生物扩增法能够在24 h内较为准确地报告结果, 特别是对于涂片阴性患者的诊断具有重要意义。由于噬菌体生物扩增法具有较高的敏感性和特异性, 因此该法在结核病的快速诊断领域中有很好的应用前景。

The authors have declared that no competing interests exist.

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