引用本文
严育忠, 胡付品, 孙康德, 范惠清, 陆燕春, 华静. 硼酸抑制纸片扩散试验检测肺炎克雷伯菌中的KPC. 2012, 27(9): 754-759
YAN Yuzhong, HU Fupin, SUN Kangde, FAN Huiqing, LU Yanchun, HUA Jing. Disk tests incorporating boracic acid inhibitor to detect KPC in Klebsiella pneumoniae . Labratory Medicine, 2012, 27(9): 754-759  
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《检验医学》编辑部
硼酸抑制纸片扩散试验检测肺炎克雷伯菌中的KPC
严育忠1, 胡付品2, 孙康德3, 范惠清1, 陆燕春1, 华静1
1. 上海浦东新区南汇中心医院检验科,上海 201300
2. 复旦大学附属华山医院抗生素研究所,上海 200040
3. 上海交通大学医学院附属第九人民医院,上海 200011

作者简介:严育忠,男,1977年生,硕士,主管技师,主要从事细菌耐药性研究。

通讯作者:陆燕春,联系电话:021-58022995。

基金:上海市浦东新区卫生科技项目(PW2011A-22)
摘要
目的

评估利用硼酸的纸片扩散试验检测肺炎克雷伯菌中肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)的效能。

方法

收集经基因鉴定非重复的36株产KPC肺炎克雷伯菌株;采用琼脂稀释法测定所有菌株对亚胺培南、美罗培南和厄他培南的最低抑菌浓度(MIC)值;聚合酶链反应(PCR)和DNA测序鉴定β-内酰胺酶基因型;使用标准和超过标准的2种测试菌量进行改良Hodge试验(MHT)以检测碳青霉烯酶表型;利用8种抗菌药物纸片含或不含硼酸抑制剂的纸片扩散试验检测KPC表型,以两者抑菌圈直径差值≥5 mm判定阳性结果。

结果

所有36株产KPC菌株至少对1种碳青霉烯类药物耐药。MHT检测碳青霉烯酶的敏感性和特异性为97.2%和91.0%,增加菌量后的敏感性和特异性为100.0%和87.0%。利用硼酸联合头孢吡肟、亚胺培南或美罗培南的纸片扩散试验检测肺炎克雷伯菌产KPC表型,敏感性和特异性均达到100.0%。

结论

硼酸联合头孢吡肟、亚胺培南或美罗培南的纸片扩散试验能检测出KPC表型,而且该方法操作简单、结果易读。

关键词: 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶; 纸片扩散试验; 抑制剂; 表型试验
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)09-0754-06
Disk tests incorporating boracic acid inhibitor to detect KPC in Klebsiella pneumoniae
YAN Yuzhong1, HU Fupin2, SUN Kangde3, FAN Huiqing1, LU Yanchun1, HUA Jing1
1. Department of Clinical Laboratory, Nanhui Central Hospital of Pudong, Shanghai 201300,China
2. Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040,China
3. The Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China
Abstract
Objective

To evaluate the disk tests incorporating boracic acid inhibitor for the detection of Klebsiella pneumoniae carbopenem (KPC)-producing Klebsiella pneumoniae isolates.

Methods

A total of 36 genetically unrelated KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolates were determined. The minimum inhibitory concentrations(MIC) of imipenem,meropenem and ertapenem were determined by agar dilution method.Polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing were used for the identification of beta-lactamase genotypes. The modified Hodge test (MHT), using both standard and high inoculum of test organisms, was performed to detect carbopenem phenotype. The disk tests consisting of 8 antibiotics with and without boracic acid inhibitor were designed to detect KPC phenotype, and the diameter≥5 mm augmentation of inhibition zone was considered a positive result.

Results

All 36 KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolates were resistant to at least one of the 3 carbopenems. The sensitivity and specificity of MHT were 97.2% and 91.0% for the detection of carbopenems, and they were 100.0% and 87.0% when a high inoculum was employed. For disk tests using cefepime, imipenem or meropenem with and without boracic acid detecting KPC phenotype in Klebsiella pneumoniae, the sensitivity and specificity were 100.0%.

Conclusions

Disk tests incorporating boracic acid inhibitor in combination with cefepime, imipenem or meropenem may help the phenotypic detection of KPC in Klebsiella pneumoniae, and are very easy to perform and interpret.

Keyword: Klebsiella pneumoniae carbopenem; Disk test; Inhibitor; Phenotypic detection

产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbopenem, KPC)的肺炎克雷伯菌自本世纪初首先发现于美国后, 很快在全世界范围内播散[1, 2]。近年来在我国许多地区均有产KPC肺炎克雷伯菌的报道[3, 4], 并有向其他肠杆菌属细菌和铜绿假单胞菌[5, 6]等播散的趋势, 因此对于肺炎克雷伯菌中产KPC菌株的检测至关重要。目前对包括KPC在内的碳青霉烯酶表型检测通常由改良Hodge试验(modified Hodge test, MHT)确证[7], 许多研究显示该试验方法虽然敏感性很高, 但其中可能包含假阳性, 特异性不高[8, 9]。硼酸为KPC的抑制剂, Tsakris等[10]利用硼酸的纸片扩散试验对肺炎克雷伯菌中的KPC进行了检测, 可有效避免假阳性结果的出现, 但在国内未见该方法应用于临床分离的肺炎克雷伯菌中产KPC菌株的检测。为此我们对本地区36株经分子鉴定含KPC基因的肺炎克雷伯菌应用该方法进行了分析研究。

材料和方法
一、材料

1. 试验菌株和质控菌株 (1)KPC阳性临床菌株:采用聚合酶链反应(PCR)扩增及DNA产物测序的方法, 从南汇中心医院2010年1至12月临床分离的肺炎克雷伯菌中剔除同一患者分离的重复菌株后, 共获得36株KPC-2基因(blaKPC-2)阳性菌株; (2)KPC阴性临床菌株:同期收集非重复的76株肺炎克雷伯菌和24株大肠埃希菌, 所有菌株经PCR鉴定均含有超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)基因(blaESBLs)和/或高产C类头孢菌素酶(Amp C)基因(blaAmp C), 但均不含blaKPC; (3)质控菌株:药物敏感性质控菌株为大肠埃希菌(ATCC 25922)和大肠埃希菌(ATCC 35218); MHT阴性对照菌株为肺炎克雷伯菌(ATCC 700603), 阳性对照菌株为一株已经DNA测序证实产KPC-2型酶的肺炎克雷伯菌431。

2. 抗菌药物纸片及标准品 纸片:头孢西丁(30 μ g)、头孢替坦(30 μ g)、头孢噻肟(30 μ g)、头孢他啶(30 μ g)、头孢吡肟(30 μ g)、亚胺培南(10 μ g)、美罗培南(10 μ g)、厄他培南(10 μ g)等药物敏感性纸片(英国Oxoid公司)。标准品:亚胺培南、厄他培南(杭州默沙东制药有限公司), 美罗培南(日本Sumitomo制药公司)。药物敏感性试验用培养基为水解酪蛋白胨(MH)琼脂(英国Oxoid公司)。

3. 仪器与试剂 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(日本TaKaRa公司)、电泳槽、凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)和加热仪等。引物由上海生工生物工程有限公司合成, PCR扩增试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。硼酸为Sigma公司产品。

二、方法

1. 药物敏感性测定 采用琼脂稀释法测定所有菌株对亚胺培南、美罗培南和厄他培南的最低抑菌浓度(MIC)值, 纸片扩散试验检测所有菌株对临床常用抗菌药物的敏感性, 试验操作与结果判断均按美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)标准[7]进行。

2. MHT 检测碳青霉烯酶 按CLSI文件推荐的方案[7], 采用MHT检测所有菌株中的碳青霉烯酶, 凡出现矢状生长现象者判断为MHT结果阳性。MHT中受试菌株数量分别以10 μ L接种环挑取3~5个菌落和无菌棉签挑取6~10个菌落, 以观察接种量对MHT结果的影响, 阴性对照菌株为肺炎克雷伯菌(ATCC 700603), 阳性对照菌株为肺炎克雷伯菌431。

3. 纸片扩散试验 操作方法与结果判断参考文献[10]:(1)纸片制备:硼酸120 mg溶解于1.5 mL的二甲基亚砜中, 加1.5 mL蒸馏水, 配成40 mg/mL溶液。将该10 μ L溶液加于抗菌药物纸片制成复合纸片, 干燥30 min, 60 min内使用; (2)KPC的检测:接种受试菌到MH平板, 贴抗菌药物单药纸片及复合纸片, 35 ℃过夜培养。若复合纸片与抗菌药物单药纸片的抑菌圈直径相差≥ 5 mm为KPC阳性。

4. PCR扩增及DNA测序 煮沸法提取细菌DNA模板, 检测超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)、质粒Amp C、KPC、金属β -内酰胺酶(MBLs)和OXA型碳青霉烯酶基因, 所需的引物序列和PCR反应条件均按参考文献[8]进行。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统观察结果并照相。PCR扩增产物送上海生工生物工程有限公司, 采用双脱氧链末端终止法测序。

5. 敏感性和特异性检测 以PCR检测结果为金标准, 评估不同抗菌药物纸片的硼酸纸片扩散试验检测KPC的效果。

结 果
一、抗菌药物敏感性试验

36株产KPC肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南和厄他培南的MIC值分别是1~> 128、2~> 128和4~> 128 μ g/mL。其中有1株对亚胺培南敏感, 2株分别对亚胺培南和美罗培南中介。在100株不产KPC菌株中, 其中16株至少对1种碳青霉烯类药物不敏感, 他们全部产Amp C, 见表1。

表1 136株受试菌对3种碳青霉烯类抗菌药物的敏感性
二、MHT和β -内酰胺酶基因检测

MHT结果显示, 36株产KPC菌株中有1株在厄他培南抑菌圈中未出现矢状, 其余35株呈阳性结果。产Amp C的菌株中, 有15.8%(9/57, 单产Amp C 6株, 同时产ESBLs和Amp C 3株)的菌株MHT呈阳性结果, 43株单产ESBLs菌株均为阴性结果。当增加测试细菌量时, 36株产KPC肺炎克雷伯菌呈阳性, 而假阳性也增加了4株, 其中3株产Amp C, 1株产ESBLs。MHT的特异性和敏感性为97.2%和91.0%, 增加菌量后的敏感性和特异性为100.0%和87.0%。见表2。

表2 MHT结果

通过PCR及DNA测序结果显示, 36株KPC阳性菌株均含blaKPC-2, 其中有29株菌株同时携带blaESBLs(26株SHV-12型和3株SHV-11型), 未检测到blaAmp C、blaMBLs或blaOXA。在MHT中, 9株假阳性菌株的blaAmp C均为DHA-1型。在增加测试菌量后, 增加了4株假阳性菌株, 分别是3株含DHA-1型blaAmp C和1株含CTX-M型blaESBLs。13株假阳性菌株对blaKPC、blaMBLs和blaOXA进行PCR扩增, 均未检测到相应产物。

三、纸片扩散试验

含硼酸的复合纸片与抗菌药物单药纸片间抑菌圈直径相差≥ 5 mm为阳性判断标准, 硼酸联合头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南和厄他培南时, 所有36株产KPC肺炎克雷伯菌均显示阳性结果, 明显表现出硼酸抑制KPC活性的特点。硼酸联合头孢他啶、头孢噻肟、头孢西丁或头孢替坦时, 分别有9、23、33和34株呈阳性结果。100株不产KPC的菌株中, 硼酸联合头孢吡肟、亚胺培南或美罗培南时均显示阴性结果; 但联合厄他培南时, 有4株呈假阳性结果(均为产Amp C菌株)。硼酸联合头孢他啶、头孢噻肟、头孢西丁和头孢替坦时的阳性菌株分别为19、24、39和42株。见图1、表3。

图1 硼酸抑制纸片扩散试验检测肺炎克雷伯菌中的KPC

表3 硼酸联合不同抗菌药物的检测结果
四、敏感性和特异性分析

硼酸联合8种抗菌药物检测KPC的敏感性和特异性, 其中头孢吡肟、亚胺培南和美罗培南的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值均为100.0%。见表4。

表4 硼酸纸片扩散试验的敏感性和特异性分析(%)
讨 论

产KPC的肺炎克雷伯菌可对所有β -内酰胺类药物耐药[2]。由于blaKPC存在于质粒上, 因此具有很强的传播性[11]。因为治疗手段的局限, 准确地鉴定产KPC菌株不仅有利于抗感染的治疗, 同时对控制此类菌株的流行传播起至关重要的作用。虽然分子诊断技术如PCR能准确鉴定KPC基因[12], 但其操作技术要求较高。CLSI推荐使用MHT进行碳青霉烯酶表型确证, 该方法简单易行, 但是除了结果判断需要经验外, 也易受到某些ESBLs和Amp C的干扰而导致假阳性结果[8, 9]。

本研究中, MHT检测碳青霉烯酶的敏感性和特异性分别为97.2%和91.0%, 与CLSI文件显示敏感性和特异性超过90%的数据相符[7]。1株假阴性标本在增加受试菌量后显示阳性结果, 疑为该受试菌产酶量少的原因, 特异性的下降主要由于受到Amp C的影响。但是国内也有研究显示MHT特异性< 90%, 假阳性率达到了30%[13]。由于细菌耐药机制流行模式的区域性差异, 对于检测方法的适用环境应做充分评估, 更应及时调整和改进目前的检测方法和思路以适应当地的细菌耐药形势。由于MHT的结果判读需要一定的经验, 某些弱阳性标本也可能会被误读成阴性, 因此存在主观性。同时本研究也发现增加受试菌量, 能提高MHT的敏感性, 怀疑是和受试菌分泌碳青霉烯酶量少有关, 有待进一步研究证实。

PCR检测及DNA测序结果显示, 本研究中36株碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌均含blaKPC-2, 未检出blaMBLs和blaOXA。在本地区, 产KPC肺炎克雷伯菌的检出率呈逐年上升的趋势, KPC-2是主要的基因型。同时本研究也发现一些非产碳青霉烯酶的菌株对碳青霉烯类药物表现为中介或耐药, 其主要耐药机制可能是菌株产质粒型Amp C且合并外膜孔蛋白缺失。

硼酸复合物可作为一种β -内酰胺酶抑制剂, 常用的有3-氨基苯硼酸和苯硼酸。他们仅作用于丝氨酸残基, 而非β -内酰胺环[14]。由于目前硼酸复合物主要应用于Amp C的表型检测[15]。有研究发现以硼酸复合物作为Amp C抑制剂时, 会把KPC误认为Amp C[16]。因为KPC也属于丝氨酸型β -内酰胺酶。有学者利用纸片扩散试验, 以含硼酸抗菌药物纸片的抑菌圈比单独抗菌药物纸片≥ 5 mm为阳性的判断标准, 检测出希腊首株产KPC的肺炎克雷伯菌[10]。该试验操作简单, 并且提供了客观的判读标准, 结果清晰易读。

本研究使用36株blaKPC阳性肺炎克雷伯菌和100株blaKPC阴性菌株对该方法进行了方法学评估。在选择的8种抗菌药物底物中, 头孢他啶和头孢噻肟的效果最差, 主要表现在合并产KPC和ESBLs的菌株中检出率低, 可能是某些ESBLs不被硼酸抑制而导致阴性结果。值得注意的是, 由于Amp C同属于丝氨酸型β -内酰胺酶, 其能干扰KPC型碳青霉烯酶的检测, 在联合头孢西丁或头孢替坦时出现了预期的低特异性。在联合厄他培南时, 4株含blaAmp C菌株也得到了假阳性结果。但是在联合美罗培南、头孢吡肟或亚胺培南时, 均能准确地鉴别KPC。即便是在对碳青霉烯类药物水解作用相对较弱(表现为低MIC)或同时携带有ESBLs基因的产KPC肺炎克雷伯菌时都能被准确鉴定。其中美罗培南的抑菌圈直径增加最明显, 效果最佳。在本研究中, 这3种抗菌药物纸片的敏感性和特异性均达到了100.0%, 明显优于MHT。

虽然利用硼酸的纸片扩散试验操作简单、实用, 可在大部分医疗机构的微生物实验室中用于肺炎克雷伯菌中KPC表型的常规检测, 但需要指出的是, 由于含硼酸的复合纸片没有商品化, 复合纸片制备的质量是保证结果可靠性的重要前提。同时在本研究中仅针对产KPC的肺炎克雷伯菌进行了研究, 其菌种收集的范围、数量也不足。为避免研究分析的偏差, 需进一步开展大样本多中心的研究。而对于该种检测方法在其他产KPC菌种和其他耐碳青霉烯类药物机制的情况下表现如何也需要进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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