引用本文
安新, 高利常, 王冬梅, 邹吉敏, 李超, 袁宝军. 2型糖尿病患者 CR1基因多态性与红细胞CR1数量、黏附活性相关性研究 . 2012, 27(9)
AN Xin, GAO Lichang, WANG Dongmei, ZOU Jimin, LI Chao, YUAN Baojun.. Study on the correlation of CR1 gene polymorphism with erythrocyte CR1 expression and its adhesive activity in patients with type 2 diabetes mellitus . Labratory Medicine, 2012, 27(9)  
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2型糖尿病患者 CR1基因多态性与红细胞CR1数量、黏附活性相关性研究
安新, 高利常, 王冬梅, 邹吉敏, 李超, 袁宝军
河北联合大学附属开滦医院检验科,河北 唐山 063000

作者简介:安 新,男,1963年生,学士,副主任技师,主要从事细胞免疫学及肝胆病学、风湿免疫病学研究。

摘要
目的

研究2型糖尿病(T2DM)患者1型补体受体( CR1)基因多态性与红细胞CR1数量、黏附活性的相关性。

方法

应用限制性内切酶Hind Ⅲ聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术测定132例T2DM患者和124名正常健康人群 CR1基因多态性,用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定红细胞的CR1数量,检测红细胞黏附活性,并做统计学分析。

结果

T2DM患者红细胞表面的CR1数量和黏附活性均低于正常对照组( P<0.01)。 CR1基因型在2组的分布频率均为HH型最高、HL型次之、LL型最低。T2DM组 CR1基因等位基因L频率为14.8%,高于对照组(11.3%),但2组 CR1基因型频率和等位基因频率差异均无统计学意义( P>0.05)。2组组内比较,HH型与HL型红细胞CR1数量及黏附活性差异均无统计学意义( Ρ均>0.05)。T2DM组HH型与HL型红细胞CR1数量与黏附活性均低于正常对照组( Ρ<0.05)。

结论

T2DM患者与正常对照者间 CR1基因型频率和等位基因频率无差异,而T2DM患者红细胞CR1数量及黏附活性减低,提示T2DM的发生与红细胞免疫功能低下有关。

关键词: 1型补体受体; 基因多态性; 红细胞; 黏附活性; 2型糖尿病
中图分类号:R446.62 文献标志码:A
Study on the correlation of CR1 gene polymorphism with erythrocyte CR1 expression and its adhesive activity in patients with type 2 diabetes mellitus
AN Xin, GAO Lichang, WANG Dongmei, ZOU Jimin, LI Chao, YUAN Baojun.
Department of Clinical Laboratory,Kailuan Affiliated Hospital of Hebei United University,Hebei Tangshan 063000,China
Abstract
Objective

To study on the correlation of complement receptor type 1 ( CR1) gene polymorphism with erythrocyte CR1 expression and its adhesive activity in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM).

Methods

A total of 132 patients with T2DM were determined for the CR1 gene polymorphism by restriction incision enzyme Hind Ⅲ polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP),and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to detect the expression of CR1 on erythrocyte and its adhesive activity.Meanwhile, 124 healthy subjects were enrolled as controls. The results were analyzed statistically.

Results

The expression of CR1 on erythrocyte and its adhesive activity in patients with T2DM were lower than those in healthy controls ( P<0.01). The CR1 genotype distribution frequencies from high to low were type HH, type HL and type LL by turns. The allele L frequency of CR1 gene in T2DM patients (14.8%) was higher than that in healthy controls (11.3%), and there was no statistical significance in CR1 genotype frequency and allele frequency between the 2 groups ( P>0.05). The expression of CR1 and adhesive activity of type HH and type HL had no statistical significance ( P>0.05). The expression of CR1 and adhesive activity of type HH and type HL in T2DM patients were significantly lower than those in healthy controls ( P<0.05).

Conclusions

The genotype and allele frequencies in patients with T2DM have no statistical difference with those in healthy controls,but the expression of CR1 on erythrocyte and the adhesive activity in patients with T2DM decrease significantly. It indicates that the decrease of erythrocyte CR1 adhesive activity may be attribute to the occurrence of T2DM.

Keyword: Complement receptor 1; Gene polymorphism; Erythrocyte; Adhesive activity; Type 2 diabetes mellitus

1型补体受体(complement receptor 1, CR1/CD35)是红细胞膜上主要的免疫物质, 是红细胞有效清除免疫复合物(IC)的物质基础, 参与许多疾病的发生及发展, 从而成为国内外学者的研究热点[1, 2, 3, 4]。2型糖尿病(T2DM)是一种慢性终身性疾病。近年来发现T2DM患者红细胞免疫功能低下, 且与病程及并发症的发生、转归密切相关[5, 6, 7]。为进一步探讨T2DM与CR1基因多态性及红细胞CR1数量、黏附活性的关系及意义, 我们对T2DM患者进行了研究。

材料和方法
一、临床资料

选择河北联合大学附属开滦医院临床确诊T2DM患者132例, 均符合世界卫生组织(WHO)1997年诊断标准, 其中男63例, 女69例, 年龄39~82岁。正常对照组124名, 来自河北联合大学附属开滦医院健康体检者, 其中男66名, 女58名, 年龄37~79岁。2组人群均排除心脑血管、血液系统、免疫系统和其他内分泌系统疾病, 未曾接受改善免疫功能的治疗。

二、检测项目及方法

1. 红细胞CR1黏附活性测定 (1)血样本处理:无菌采集所有对象清晨空腹外周血2 mL, 枸橼酸钠抗凝, 780× g离心, 使红细胞沉淀备用; (2)靶细胞配置:37 ℃溶解已分装冰冻的靶细胞(肿瘤细胞), 加入1 mL生理盐水, 混匀, 2 100× g离心5 min, 吸净上清液(切勿吸掉细胞), 加入150 μ L生理盐水混匀, 备用; (3)加样:取1 μ L红细胞和100 μ L血浆加入靶细胞管, 混匀, 37 ℃水浴30 min后加200 μ L缓冲液, 轻轻颠倒混匀; (4)结果判断和计数:取150 μ L反应液置玻片中央, 加一滴瑞姬氏染液并水平涂开, 显微镜下计数100个靶细胞, 结合5个以上红细胞的靶细胞为一个单位, 计算“ 黏附率” , 即黏附活性。试剂盒购自解放军302医院检验中心免疫室。

2. 红细胞CR1分子定量测定 采用文献[8]的测定方法, 试剂盒购自解放军302医院检验中心免疫室。

3. CR1基因多态性测定 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术, 限制性内切酶 Hind Ⅲ 酶切位点位于结构基因内含子。参考文献[9]合成引物。引物1:5'-CCT TCAATGGAATGGTGCAT-3'; 引物2:5'-CCCTTG TAAGGCAAGTCTGG-3'。取待检者抗凝血0.1 mL, 用碘化钠法提取模板DNA。PCR反应总体积30 μ L, 其中模板DNA 3 μ L、引物1和2各0.4 μ L、TaqDNA聚合酶0.1 μ L、4× dNTP 2.4 μ L、10× PCR buffer 3 μ L, 加超纯水至30 μ L, 充分混匀后短暂离心。循环参数:94 ℃预变性4 min后, 94 ℃ 60 s, 55 ℃ 50 s, 72 ℃ 50 s, 扩增30个循环后, 72 ℃延伸5 min。产物酶切:取扩增产物14 μ L, 加入内切酶Hind Ⅲ 6 μ L并充分混匀, 置于37 ℃水浴2 h。将酶切产物于1%琼脂糖凝胶中电泳, 紫外观察。酶切后只出现1.8 kb 1条条带的为HH型(高表达型), 出现1.8、1.3和0.5 kb 3条条带的为HL型(中表达型), 出现1.3和0.5 kb 2条条带的为LL型(低表达型), 由此计算基因型频率和等位基因频率。试剂盒购于解放军302医院检验中心免疫室。

三、统计学方法

计量资料用t检验, 计数资料用χ 2检验, Ρ < 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、T2DM组和正常对照组红细胞CR1数量及黏附活性变化

T2DM组红细胞CR1数量及黏附活性均低于正常对照组(Ρ < 0.01), 见表1。

表1 T2DM组与正常对照组红细胞CR1数量及黏附活性比较
二、T2DM组和正常对照组CR1基因多态性分布

T2DM组与正常对照组CR1基因型频率差异无统计学意义(χ 2=1.824, Ρ > 0.05); T2DM组CR1等位基因L频率为14.8%, 正常对照组等位基因L频率为11.3%, 两者差异无统计学意义 (χ 2=1.3635, Ρ > 0.05)。2组3种基因型频率见表2。

表2 T2DM组与正常对照组CR1基因多态性比较
三、T2DM组和正常对照组CR1基因不同基因型红细胞CR1数量及黏附活性分析

比较CR1基因HH、HL、LL 3种基因型的红细胞CR1数量与黏附活性。T2DM组和正常对照组组内比较, HH型红细胞CR1数量与黏附活性虽均高于HL型, 但差异无统计学意义(P> 0.05)。LL型因样本量小而未进行统计学处理。2组间同种基因型比较, T2DM组HH型、HL型红细胞CR1数量与黏附活性均低于正常对照组(Ρ < 0.05)。见表3。

表3 T2DM组与正常对照组CR1基因不同基因型红细胞CR1数量及黏附活性分析
讨 论

人CR1是一种相对分子质量为160 000~250 000的单链膜糖蛋白, 广泛分布于红细胞和白细胞等多种细胞, 且绝大多数CR1呈簇状分布于红细胞。每个红细胞平均含有500个左右CR1, 与年龄和性别无明显关系[10]。CR1是补体C3b的受体, 是红细胞免疫功能的物质基础之一。研究证实, 红细胞CR1有清除体内循环免疫物, 调节细胞免疫和体液免疫等功能[10, 11]。T2DM患者体内存在数量众多的循环免疫复合物(IC), CR1数量及黏附活性变化与病程及并发症的发生、发展密切相关[5, 6, 7]。

CR1存在于红细胞、白细胞等多种细胞表面, 但CR1基因多态性只在红细胞上表达, 这是红细胞CR1与其他细胞CR1所不同之处[12]。人CR1为常染色体共显性遗传, 该基因由2个复杂多样化的等位基因构成, 位于1号染色体32区的补体激活调节子区[13, 14, 15]。根据长同源序列(LHR)转录本是4个还是5个LHR可分为CR1S和CR1F 2个等位基因。而决定红细胞CR1数量表达高低的是位于LHR-D的第2个短一致重复序列(SCR)27号内含子的点突变。由于该点突变, 出现Hind Ⅲ 新酶切位点, 表现为CR1基因HH、HL、LL 3种基因型。CR1等位基因正常为H型, 突变后为L型。等位基因无Hind Ⅲ 新酶切位点, 为HH型(纯合子), 酶切电泳只有1.8 kb片段; HL型(杂合子)有1个Hind Ⅲ 新酶切位点, 可见1.8、1.3和0.5 kb 3个片段; LL型(纯合子)有2个Hind Ⅲ 新酶切位点, 可见1.3和0.5 kb 2个片段。这种点突变主要由父母遗传, 但也可后天获得[16, 17, 18, 19]。

红细胞表面CR1数量与其黏附活性呈明显正相关[18]。红细胞CR1数量的变化主要由遗传因素即基因型决定。但在红细胞免疫功能过程, CR1因清除IC被消耗或封闭而造成数量有所下降[20]。本研究结果显示T2DM组和正常对照组CR1基因型频率HH型最高、HL型次之、LL型最低, T2DM组红细胞CR1等位基因L频率高于对照组, 但T2DM患者CR1基因型频率和等位基因频率与正常对照组相比并无明显差异。而T2DM组红细胞CR1数量及黏附活性均低于正常对照组。提示T2DM患者红细胞CR1数量及黏附活性变化比CR1基因型频率变化更显著。故可将红细胞CR1数量及黏附活性变化作为T2DM研究的重要指标。

在2组组内对比中, CR1基因型频率无明显差异, 红细胞CR1数量与黏附活性HH型与HL型无明显差异。提示T2DM患者红细胞免疫功能的改变与CR1基因型频率关系不密切。而组间同种基因型对比可见T2DM组HH型、HL型红细胞CR1数量与黏附活性均低于正常对照组(Ρ < 0.05)。提示T2DM患者红细胞免疫功能的改变与CR1基因的表达或后天获得性因素有关。虽然CR1基因在T2DM患者和健康人群分布一致, 但在mRNA水平或蛋白质翻译阶段可能存在某种未知的调控机制, 导致末端产物CR1分子表达水平降低, 进一步影响红细胞免疫功能。或者T2DM患者处于高血糖水平, 引起红细胞膜代谢改变, 造成红细胞膜上CR1封闭或因清除IC被大量消耗而致CR1数量和黏附活性减低。本研究结果显示T2DM患者红细胞CR1数量及黏附活性减低, 提示T2DM的发生与红细胞免疫功能低下有关。但T2DM的发生和CR1数量及黏附活性降低之间的因果关系还需进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Sinha S, Jha GN, Anand P, et al. CR1 levels and gene polymorphisms exhibit differential association with falciparum malaria in regions of varying disease endemicity[J]. Hum Immunol, 2009, 70(4): 244-250. [本文引用:1]
[2] 岳展依. 结肠癌患者红细胞CR1基因多态性的临床研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2010, 20(12): 3281-3282. [本文引用:1]
[3] Boiocchi C, Zorzetto M, Sbarsi I, et al. CR1 genotype and haplotype involvement in coronary artery disease: the pivotal role of hypertension and dyslipidemia[J]. Int J Mol Med, 2009, 24(2): 181-187. [本文引用:1]
[4] Wakabayashi M, Ohi H, Tamano M, et al. Acquired loss of erythrocyte complement receptor type 1 in patients with diabetic nephropathy undergoing hemodi-alysis[J]. Nephron Exp Nephrol, 2006, 104(3): e89-e95. [本文引用:1]
[5] Ruuska PE, Ikäheimo I, Silvennoinen-Kassinen S, et al. Normal C3b receptor (CR1) genomic polymor-phism in patients with insulin-dependent diabetes mellitus(IDDM): is the low erythrocyte CR1 expre ssion an acquired phenomenon[J]. Clin Exp Immunol, 1992, 89(1): 18-21. [本文引用:2]
[6] Noorchashm H, Moore DJ, Lieu YK, et al. Contribution of the innate immune system to autoimmune diabetes: a role for the CR1/CR2 complement receptors[J]. Cell Immunol, 1999, 195(1): 75-79. [本文引用:2]
[7] 卢大雷. Ⅱ型糖尿病患者红细胞天然免疫功能变化与CR1密度基因多态性的相关分析[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2003, 23(5): 332-334. [本文引用:2]
[8] 王海滨, 张景萍, 沈茜. 红细胞补体受体1型分子定量测定法[J]. 中华检验医学杂志, 1999, 22(6): 342-343. [本文引用:1]
[9] Cornillet P, Philbert F, Kazatchkine MD, et al. Genomic determination of the CR1(CD35) density poly-morphism on erythrocytes using polymerase chain reaction amplification and HindⅢ restriction enzyme digestion[J]. J Immunol Methods, 1991, 136(2): 193-197. [本文引用:1]
[10] Rochowiak A, Niemir ZI. The structure and role of CR1 complement receptor in physiology[J]. Pol Merkur Lekarski, 2010, 28(163): 79-83. [本文引用:2]
[11] Boackle SA. Complement and autoimmunity[J]. Biomed Pharmacother, 2003, 57(7): 269-273. [本文引用:1]
[12] Katyal M, Tiwari SC, Kumar A, et al. Association of complement receptor 1(CR1, CD35, C3b/C4b receptor) density polymorphism with glomerulonephritis in Indian subjects[J]. Mol Immunol, 2004, 40(18): 1325-1332. [本文引用:1]
[13] Buraczynska M, Ksiazek P, Wacinski P, et al. Complement receptor 1 gene polymorphism and cardio-vascular disease in dialyzed end-stage renal disease patients[J]. Hum Immunol, 2010, 71(9): 878-882. [本文引用:1]
[14] Krych-Goldberg M, Atkinson JP. Structure-function relationships of complement receptor type 1[J]. Immunol Rev, 2001, 180: 112-122. [本文引用:1]
[15] Carroll MC, Holers VM. Innate autoimmunity[J]. Adv Immunol, 2005, 86: 137-157. [本文引用:1]
[16] Liu D, Niu ZX. The structure, genetic polymorphisms, expression and biological functions of complement receptor type 1(CR1/CD35)[J]. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2009, 31(4): 524-535. [本文引用:1]
[17] Rout R, Dhanqadamajhi G, Mohapatra BN, et al. High CR1 level and related polymorphic variants are associated with cerebral malaria in eastern-India[J]. Infect Genet Evol, 2011, 11(1): 139-144. [本文引用:1]
[18] Wong WW, Cahill JM, Rosen MD, et al. Structure of the human CR1 gene. Molecular basis of the structural and quantitative polymorphisms and identification of a new CR1-like allele[J]. J Exp Med, 1989, 169(3): 847-863. [本文引用:2]
[19] Krych-Goldberg M, Moulds JM, Atkinson JP. Human complement receptor type1(CR1) binds to a major malarial adhesin[J]. Trends Mol Med, 2002, 8(11): 531-537. [本文引用:1]
[20] Senbagavalli P, Geetha ST, Karunakaran K, et al. Reduced erythrocyte CR1 levels in patients with pulmonary tuberculosis is an acquired phenomenon[J]. Clin Immunol, 2008, 128(1): 109-115. [本文引用:1]