引用本文
高晶, 陈秋静, 张彬, 陆林, 张瑞岩, 张奇, 胡健, 杨震坤, 沈卫峰. α2肾上腺素受体基因多态性与2型糖尿病患者伴无症状心肌缺血的关系 . 2012, 27(9): 701-706
GAO Jing, CHEN Qiujing, ZHANG Bin, LU Lin, ZHANG Ruiyan, ZHANG Qi, HU Jian, YANG Zhenkun, SHEN Weifeng. The relationship of alpha2 -adrenergic receptor gene polymorphism with silent myocardial ischemia in patients with type 2 diabetes mellitus . Labratory Medicine, 2012, 27(9): 701-706  
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α2肾上腺素受体基因多态性与2型糖尿病患者伴无症状心肌缺血的关系
高晶1, 陈秋静2, 张彬1, 陆林2, 张瑞岩2, 张奇2, 胡健2, 杨震坤2, 沈卫峰2
1. 复旦大学附属妇产科医院检验科,上海 200011
2. 上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科,上海 200025

作者简介:高 晶,女, 1982年生,学士,技师,从事临床医学检验工作。

基金:上海市自然科学基金资助项目(028610)
摘要
目的

探究α2A肾上腺素受体(α2A- AR)、α2B- AR和α2C- AR基因多态性与患冠心病(CAD)的2型糖尿病(T2DM)患者伴无症状心肌缺血(SMI)的关系。

方法

采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和基因测序法对107名正常对照者、129例T2DM伴SMI患者和192例T2DM伴心绞痛患者α2A - AR、α2B- AR和α2C- AR基因多态性进行分析。

结果

α2B- AR基因多态性[插入(I)/缺失(D)]的基因型分布与等位基因频率在SMI组和心绞痛组之间均存在明显差异( P均<0.05)。SMI组I/I 基因型频率为34.9%,明显高于心绞痛组(19.8%, P=0.002)。

结论

α2B-AR基因多态性I/I基因型与患有CAD的T2DM患者发生SMI有关。

关键词: α2肾上腺素受体; 基因多态性; 无症状心肌缺血; 糖尿病
中图分类号:R446.62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)09-0701-06
The relationship of alpha2 -adrenergic receptor gene polymorphism with silent myocardial ischemia in patients with type 2 diabetes mellitus
GAO Jing1, CHEN Qiujing2, ZHANG Bin1, LU Lin2, ZHANG Ruiyan2, ZHANG Qi2, HU Jian2, YANG Zhenkun2, SHEN Weifeng2
1. Department of Clinical Laboratory, Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, Shanghai 200011,China
2. Department of Cardiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
Abstract
Objective

To investigate the relationship of alpha2-adrenergic receptor ( AR) gene polymorphisms (α2A- AR, α2B- AR and α2C- AR genes) with silent myocardial ischemia (SMI) in coronary artery disease (CAD) patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM).

Methods

By polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and gene sequencing, α2A- AR, α2B- AR and α2C- AR gene polymorphism analysis was performed in 107 healthy controls, 129 T2DM patients with SMI and 192 T2DM patients with angina.

Results

The genotype distribution and allele frequencies of α2B- AR gene polymorphism [insertion (I)/deletion (D)] had significant difference between SMI group and angina group ( P<0.05), with genotype I/I frequency being greatly higher in SMI group (34.9%) than in angina group (19.8%, P=0.002).

Conclusions

Genotype I/I of α2B- AR gene polymorphism is associated with SMI in CAD patients with T2DM.

Keyword: Alpha2-adrenergic receptor; Gene polymorphism; Silent myocardial ischemia; Diabetes mellitus

无症状心肌缺血(silent myocardial ischemia, SMI)是指缺乏胸痛或与心肌缺血相关的主观症状情况下心肌缺血[1, 2], 多见于糖尿病(diabetes mellitus, DM)患者, 其发生率为10%~30%[3]。因此, 对患有冠心病(coronary artery disease, CAD)的糖尿病患者进行SMI筛查是十分必要的[4]。α 2-肾上腺素受体(adrenergic receptor, AR)广泛分布于中枢和外周神经系统, 共同参与调节交感系统的多种生理功能, 并与心血管疾病发病和疼痛调节有关[5]。α 2-AR有3种亚型, 即α 2A-AR、α 2B-AR和α 2C-AR[5]。α 2A-AR、α 2B-AR和α 2C-AR的基因依次定位于10、2和4号染色体上, 已发现人类α 2B-AR基因的插入(insertion, I)/缺失(deletion, D)多态性(3个谷氨酸残留物)(rs4066772)在受体第3细胞内环影响脱敏功能[6, 7]。α 2A-AR启动子区域C-1291G 多态性 (rs1800544) 及α 2C-AR基因4个氨基酸缺失多态性 (rs2234888) 分别被报道与神经和心血管疾病相关[8, 9]。然而, 仍未被发现这些遗传变异与SMI的潜在关联, 特别是在DM方面。

为此, 我们对患有CAD的2型DM(type 2 diabetes mellitus, T2DM)伴SMI患者和T2DM伴心绞痛患者的α 2A-AR、α 2B-AR和α 2C-AR基因多态性分布情况进行了分析。

材料和方法
一、研究人群

随机选取上海交通大学医学院附属瑞金医院体检中心107名无糖尿病及CAD、无正在使用营养补充剂或药物、肝肾功能和心电图正常者作为对照组, 男72名, 女35名, 年龄51~85岁。选取上海交通大学医学院附属瑞金医院2005年1月至2006年2月心脏内科门诊及住院患者经血管造影证实患有CAD的T2DM患者321例, 其中T2DM伴SMI患者129, 男92例, 女37例, 年龄45~84岁; T2DM伴心绞痛患者192例, 男124例, 女68例, 年龄44~89岁。

二、诊断标准

CAD诊断依据冠状动脉造影结果。冠状动脉管腔狭窄≥ 70%定义为CAD, 冠状动脉左主干狭窄≥ 50%作为2支血管病变。129例T2DM伴SMI患者在24 h动态心电图检查中有瞬时的无症状ST段压低, 为SMI组。192例T2DM伴心绞痛患者心电图检查符合心绞痛, 并有心绞痛或心绞痛相关事件, 归为心绞痛组。入选患者排除了急性心肌梗死、严重心力衰竭、需要透析治疗的肾功能衰竭、有严重危及生命的疾病或炎症患者。通过C -肽测定排除1型DM患者。本研究经医院伦理委员会批准, 并获得了知情同意书。

三、方法

1. 生化项目评估 采集禁食8 h以上的空腹血, 分离血清并在-80 ℃冻存。测定血糖、血脂[包括总胆固醇(TG)、甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、脂蛋白(a)、载脂蛋白A1(apo A1)、载脂蛋白B100(apo B100)]和肾功能[包括尿素(Urea)、肌酐(Cr)和尿酸(UA)]水平。仪器为美国贝克曼-库尔特公司全自动LX-20型生化分析仪, 试剂为美国贝克曼-库尔特公司提供的原装试剂盒。

2. 引物设计 应用引物设计软件(美国ABI公司)设计引物, 见表1。

表1 引物设计

3. DNA提取 使用新鲜血液及DNA提取试剂盒(美国Qiagen公司)来制备基因组DNA。DNA在使用前冻存于-80 ℃。

4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)和基因分型 用PCR和限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)或测序的方法进行基因分型。PCR反应体系为50 μ L, 包括PCR缓冲液、10 pmol引物、2.5单位Taq DNA聚合酶(美国Promega公司)和0.5 μ g模板DNA。PCR反应条件:94 ℃变性5 min、94 ℃变性60 s、退火60 s、72℃延伸60 s, 经35个循环, 最后于72 ℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳, 先用纯化试剂盒(美国Promega公司)进行纯化, 再使用ABI PRISM 3700 DNA分析仪(美国ABI公司)测序并进行多态性分析。

四、统计学分析

应用SPSS13.0统计学软件。连续变量用 x̅± s表示, 分类变量用频率表示。用Kolmolgorov- Smirnov试验检验数据是否符合正态性分布。在统计分析之前对非正态分布的连续变量进行对数变换。用非配对t检验或方差分析进行组间比较。分类变量的比较用卡方检验。用多变量Logistic回归模型评估SMI的独立危险因素, 双侧P≤ 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、基线特征

正常对照组、SMI组和心绞痛组在年龄、性别方面无差异, SMI组和心绞痛组在年龄、性别、吸烟、血压、体重指数(body mass index, BMI)、血脂、肾功能、CAD严重程度及用药方面无差异, SMI组患者罹患T2DM的持续时间高于心绞痛组(P=0.003), 见表2。

表2 正常对照组、糖尿病伴SMI患者和心绞痛患者的比较
二、多态性基因型分布与等位基因频率

SMI组和心绞痛组基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。2组α 2B-AR I/D基因多态性基因型分布与等位基因频率差异均有统计学意义(P值分别为0.008、0.037)。SMI组I/I基因型频率(34.9%)显著高于心绞痛组(19.8%, P=0.002), 见表3。2组α 2A-AR C-1291G与α 2C-AR I/D多态性基因型分布及等位基因频率差异无统计学意义(P> 0.05)。正常对照组α 2B -AR基因I/D多态性 D/D、I/D和I/I的基因型频率分别为15.0%、57.9%及27.1%, 与SMI组和心绞痛组比较差异均无统计学意义(P均> 0.05)。α 2A-AR

表3 多态性基因型分布和等位基因频率

(-1291C/G)多态性位点的RFLP图谱见图1。α 2B-AR(I/D, 301/301) PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图2。α 2C-AR(I/D, 325/322)DD型测序图见图3, α 2C-AR(I/D, 325/322)II型测序图见图4, α 2C-AR(I/D, 325/322)ID型测序图见图5。

图1 α 2A-AR(-1291C/G) 多态性位点的RFLP图谱

图2 α 2B-AR (I/D, 303/301)PCR产物琼脂糖凝胶电泳

图3 α 2C -AR(I/D, 325/322)DD型测序图

图4 α 2C -AR(I/D, 325/322)II型测序图

图5 α 2C -AR(I/D, 325/322)ID型测序图

三、多变量回归分析

用多变量Logistic回归分析评估DM患者发生SMI的独立危险因素, 包括基因和心血管疾病危险因素。结果显示, 罹患DM的持续时间和α 2B-AR基因多态性的I/I基因型是T2DM患者发生SMI的独立危险因素, 见表4。

表4 T2DM患者发生SMI的多变量Logistic回归分析
讨 论

DM患者有65%~80%死于冠状动脉疾病[10, 11]。然而, DM患者SMI产生的机制仍然不明。由于神经病变是DM的主要并发症, 本研究结果显示罹患DM的持续时间是发生SMI的独立危险因素。重要的是, 本研究发现α 2B-AR I/D多态性I/I基因型与DM患者发生SMI有关。对无症状CAD来说, 这可能是一个新的遗传学危险因素的发现。

α 2A-AR、 α 2B-AR和α 2C-AR都有基因多态性。已有研究表明α 2B-AR I/D基因多态性与心血管疾病有关, 其中D/D基因型与CAD急性发作、院前致死性心肌梗死/心源性猝死以及高血压有关[12]。过表达α 2B-AR的D多态性基因虽然不影响配体结合, 但能降低G蛋白偶联受体激酶介导的磷酸化, 造成短期促进激动剂脱敏功能完全丧失[7]。脱敏过程可调节细胞生理状态并应对环境的改变。这些发现表明α 2B-AR基因D多态性在功能调节能力方面较I等位基因差。由此推测在α 2-AR激动剂刺激下, I/I基因型可能更与镇痛作用相关。在DM状态下, 由于交感神经的紧张度增加等因素, 使疼痛的耐受力增加, 这些过程可能加速了DM进展, 并与遗传易感性共同导致DM患者SMI的发生。

α 2A-AR和α 2C-AR基因多态性与神经精神疾病和心血管疾病有关[8, 9]。Leiphart等[13]在发生神经性疼痛的神经组织内发现这2种受体亚型的mRNA表达改变。动物实验表明α 2A-AR、α 2C-AR及α 2B-AR同样和疼痛的感知和调节有关[14]。本研究结果显示α 2A-AR和α 2C-AR基因多态性频率在SMI和心绞痛患者之间差异无统计学意义。这需要更大样本量的研究来确认这些结果。

本研究也存在一些局限性。首先, 目前研究中SMI的检测方法是不够的。从DM患者中筛选出SMI者的方法仍不明确。运动耐力测试、动态心电图记录、负荷超声心动图和计算机断层扫描冠状动脉钙化常常用来检测SMI, 但心肌灌注显像似乎更加准确。其次, 2组样本量相对较小, 因此除α 2B-AR基因多态性之外, 其他基因型和等位基因频率的显著差异较难检出。再次, 本研究中的SMI患者被定义为动态心电图过程中有瞬时无症状ST段压低的CAD患者[15], 而另一些研究则使用压力测试检查。因此, 本研究可能会丢失部分在压力或严重劳累而非休息状态下发生SMI的患者。

综上所述, α 2B-AR基因多态性I/I基因型与患有CAD的T2DM患者发生SMI有关。

The authors have declared that no competing interests exist.

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