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钟驾云 综述, 周庭银 审校. 血流感染实验诊断的研究进展. 2012, 27(8): 692-696
  
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血流感染实验诊断的研究进展
钟驾云 综述, 周庭银 审校
1. 第二军医大学长征临床医学院,上海 200001

作者简介:钟驾云,男,1988年生,学士,主要从事临床检验研究。

摘要
关键词: 血流感染; 实验诊断; 研究进展
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)08-0692-05

血流感染的发病率较高, 常导致患者死亡。据报道, 美国每年有65万~75万人死于脓毒症。有学者通过对美国400家急诊中心的调查显示, 约2.8%的急诊患者因为怀疑存在血流感染而需要做血培养[1]。早期做出血流感染的诊断对患者的预后有重要意义。血流感染的诊断依赖于血培养和非培养的辅助检测, 自动化血培养仪、一些生物标志物的检测和分子生物学检测技术对血流感染的快速及准确诊断起了重要作用, 现将其综述如下。

一、自动化血培养系统

1. BacT/ALERT自动化血培养系统 该系统在培养瓶底部安装颜色不可逆的液乳感应器, 当血培养瓶内有细菌生长时, 可分解培养基中代谢基质从而释放出CO2, 进入感应器后水合产生H+使pH值改变, 感应器上的液乳由墨绿变黄。机载的光发射二极管定时发光一次投射到感应器上, 再由光电探测器测定反射光。反射光强度值传送至计算机后按相关公式判断血培养瓶内是否有细菌生长[2]。Wilms等[3]将0.5 麦氏单位的苛养菌(如肺炎链球菌等)悬液稀释10万倍后, 取1 mL注入BacT/ALERT FA 培养瓶检测, 其阳性率可达92.5%, 平均阳性报警时间为26.7 h。Saito等[4]使用BacT/ALERT系统检测了6 229套血培养, 共检出530株常见细菌和酵母菌, 其中501株系统可在3 d内阳性报警, 523株在5 d内报警。

2. Bactec 9000自动化血培养系统 该系统采用荧光增强的检测原理。当培养瓶中有细菌或真菌生长时, 其代谢产物CO2可激活培养瓶底部的荧光感应介质, 同时在光发射二极管发射的光激发下荧光感应介质产生荧光。荧光强度和CO2的产生量呈正比, 通过光电比色检测仪定时对荧光强度进行检测, 荧光强度值传输到计算机后根据公式判断有无细菌生长[2]。Ozturk等[5]对23例布氏菌病患者抽血用Bactec 9240系统检测, 发现19例标本于7 d内阳性报警。Janapatla等[6]对我国台湾1 565瓶阳性血培养瓶分析发现, 630例(40.3%)在厌氧和需氧瓶内都可生长, 580例(37.1%)检出微生物仅在需氧瓶内生长, 355例(22.7%)仅在厌氧瓶内生长, 故厌氧瓶和需氧瓶配套使用可提高检出率。

3. VITAL自动化血培养系统 该系统采用同源荧光技术。培养瓶液体内含有的荧光分子, 当有细菌生长时, 其生长代谢过程中或产生CO2使pH值改变或使培养基的氧化还原电势改变, 从而使结合的荧光分子发生衰变而成为无荧光的物质, 导致培养瓶内发生荧光衰减。通过荧光探头检测荧光衰减程度可报告血培养瓶内有无细菌生长[2]。Spanjaard等[7]比较了VITAL和BacT/ALERT自动血培养系统对临床血液标本的检出率, 发现VITAL厌氧瓶对假单胞菌科的检出率高于BacT/ALERT系统, 但对葡萄球菌属的检出率则低于BacT/ALERT系统。

4. VersaTREK和ESP自动化血培养系统 该系统采用气压传感技术, 主要测定原理为细菌在生长过程中消耗O2, 产生N2、H2和CO2, 导致培养瓶内气压改变。通过压力传感器监测瓶内压力变化, 将数据传入计算机后绘制压力变化曲线, 判断有无细菌生长。王升等[8]使用VersaTREK 240-4全自动血培养仪检测930例标本发现, 阳性报警时间< 12 h者占21.9%, < 24 h者占68.3%, < 48 h 者占90.2%。但Bonilla等[9]认为该系统对金黄色葡萄球菌的检出能力弱于Bactec 9000系统。该系统还推出了REDOX EZ培养瓶, 可减少采血量但不影响常见菌的检出率[10]。Han等[11]对805例ESP-384自动化培养仪阳性报警时间分析发现, 671例(83.4%)在48 h内系统发出阳性报警, 758例(94.2%)在72 h内系统发出阳性报警。

二、生物标志物检测

除了血培养以外, 还有降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、白细胞介素6(IL-6)和内毒素等检测可辅助诊断血流感染。

1. PCT PCT是一种无激素活性降钙素前肽物质, 由116个氨基酸组成, 相对分子质量为13 000, 半衰期为25~30 h。健康人群血清中PCT浓度极低(< 0.1 ng/mL), PCT在细菌感染后2 h内升高, 严重细菌感染病例血清PCT升高非常显著, 经抗菌药物治疗后迅速下降。轻度外周感染但无血流感染患者血浆PCT水平正常或轻微升高[2]。Barati等[12]研究发现烧伤合并脓毒症患者相比对照者PCT水平显著升高。Santuz等[13]认为PCT在诊断和预测新生儿败血症中有较大的研究意义, 是否需要联合其他血清标志物仍待进一步研究。

2. CRP CRP是一种由炎症细胞因子介导的、在肝脏合成的、能与肺炎链球菌C多糖发生反应的急性时相反应蛋白。一般在细菌感染后的12~18 h升高, 具有激活补体、促进吞噬和免疫调理作用。血清中CRP水平主要受炎症影响, 其在血液中浓度一般相对稳定, 不受放疗、化疗和皮质激素治疗等影响[2]。Tappero等[14]总结了多篇文献发现, 对新生儿脓毒症患儿血清CRP的敏感性为60%, 特异性为60%~90%。但Barati等[12]研究发现血清CRP浓度对于鉴别烧伤患者是否并发脓毒症意义不及PCT。

3. IL-6 IL-6是细胞因子网络中的重要成员, 由212个氨基酸组成。IL-6具有广泛的生物学活性, 是一种多功能细胞因子, 对体液免疫和细胞免疫均有调节作用, 在炎症刺激下, 体内多种细胞可以产生IL-6。IL-6能够刺激肾上腺素、皮质醇的释放, 并选择性激活凝血系统, 可介导肝脏的急性期反应, 刺激CRP的生成, 因而是一种非常重要的炎性介质。多种感染性疾病可以导致血清IL-6水平升高, 而且IL-6水平与患者预后密切相关[2]。Mokart等[15]通过对50例手术患者研究后发现, IL-6可作为外科肿瘤术后预测脓毒症的早期指标。

4. 内毒素 内毒素是革兰阴性菌细胞壁结构中的类脂多糖体(脂多糖), 此种脂多糖经细胞壁合成后被转运到细胞表面构成胞壁外膜成分, 在细菌死后从细胞结构中释放出来。内毒素及其活性中心(类脂A)对宿主具有多种毒害作用, 从而导致组织损伤并与许多临床症状有密切关系。细菌内毒素检测是诊断和监测细菌性(特别是革兰阴性菌)感染的一个重要参数[2]。Marshall等[16]研究发现脓毒症患者全血内毒素水平[(470± 57) pg/mL]显著高于未发生脓毒症的患者[(157± 140) pg/mL], 故对脓毒症有较高的预测价值。

三、分子生物学检测技术

近年来, 分子生物学技术逐步用于血流感染诊断中, 由于其可直接快速地从阳性血培养瓶中鉴定细菌种类和检测耐药基因, 正被更多的临床实验室所认可。其中又以荧光标记原位分子杂交(FISH)、聚合酶链反应(PCR)和基因芯片技术最为常用[17]。质谱技术和流式细胞术也在逐步运用于临床。

1. FISH 使用荧光标记的寡核苷酸探针特异性结合细菌的16S rRNA和真菌的18S rRNA(或26S rRNA)后, 在荧光显微镜下即可观察到荧光的产生。此法具有可快速鉴定细菌和真菌的种属、价格低廉和无需特殊设备的优点, 并且此法有较高的敏感性和特异性。Gescher等[18]通过对428瓶阳性血培养液采用FISH检测发现, 该法对革兰阳性球菌的敏感性和特异性分别达98.65%和99.0%。Shepard等[19]使用核酸肽(PNA)-FISH对197瓶阳性血培养液检测白念珠菌和光滑念珠菌, 敏感性分别达到98.7%和100.0%, 特异性均为100.0%, 比传统方法更加快捷, 并且可及时将经验用药由卡泊芬净转换为氟康唑, 减少治疗成本[20]。此外国外尚有使用FISH从阳性血培养液中直接检测肠杆菌科细菌是否产生超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)的报道[21]。可见该法在血培养瓶中直接检测耐药基因的前景十分可观。

2. PCR PCR技术近年来在临床微生物检测中运用日趋广泛, 其敏感性高。Selva等[22]用该技术对128瓶阳性血培养液检测肺炎链球菌, 其敏感性可达94%。Pechorsky等[23]使用PCR对61瓶阳性血培养液检测铜绿假单胞菌等5种常见细菌, 其中有25份标本PCR检测出1种以上的细菌, 而对这些标本用琼脂分离培养却只得到1种细菌, 故该法亦存在假阳性。有学者认为该法假阳性高可能与细菌发生回复突变有关[17]。目前国外尚有用多重PCR技术直接从未经培养的患者全血中检测和鉴定细菌种类的报道[24]。另外PCR技术可以直接从阳性血培养液中检测相关耐药基因。Pereira等[25]用多重PCR检测25瓶阳性血培养液中的mecA基因, 共发现18株耐甲氧西林株, 通过苯唑西林表型试验发现19株, 两者符合率高。但PCR成本较高且对临床实验室的设备要求复杂, 使用仍然有一定的限制。

3. 基因芯片技术 又称为DNA微阵列技术, 将大量的DNA探针如基因片段、人工合成的寡核苷酸等有序地固定在载体(玻片、硅片、尼龙膜等)表面, 再将样本DNA(RNA)通过PCR或逆转录(RT)-PCR扩增并加入标记分子后, 与制备好的已知序列杂交, 通过激光共聚焦显微扫描技术等方法检测杂交信号的强弱程度, 用相关软件对数据进行处理后即可得到标本中大量基因序列特征和基因表达特征信息[2]。Tissari等[26]对从英国和芬兰收集的2 107瓶阳性血培养液采用多重PCR联合基因芯片技术分析, 其敏感性可达94.7%。该技术尚可检测细菌的毒力因子和抗菌药物耐药基因。Palka-Santini等[27]用该技术检测血培养瓶中金黄色葡萄球菌tsst-1、sea等毒力因子和mecA、aacA-aphD等耐药基因, 均取得了相对满意的结果, 目前正在进一步研究中。Yoo等[28]用该技术鉴定阳性血培养瓶中的细菌时, 错误地将C群链球菌、口腔链球菌和缓症链球菌各1株鉴定为肺炎链球菌, 说明基因芯片技术在鉴定同种属细菌时敏感性仍然不高。

4. 质谱技术 质谱技术主要是利用特定离子源将待测标本转变为高速运动的离子, 这些离子根据质量/电荷比的不同在电场或磁场作用下得到分离, 并用检测器记录各种离子的相对强度, 形成质谱图用于分析, 提供可靠的鉴定结果。目前用于微生物检测鉴定的质谱技术主要是气相色谱- 质谱联用技术(GC - MS)、液相色谱- 质谱联用技术(LC - MS)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI- TOF-MS)及热裂解亚稳态原子轰击质谱( Py - MAB - MS)等[29]。Christner等[30]分别用MALDI- TOF-MS和常规生化鉴定法检测了304瓶阳性血培养液, 发现MALDI- TOF-MS的符合率达到95%(262/277), 应用前景十分可观。

5. 流式细胞术 流式细胞术是一种对液流中排成单列的细胞或其他生物微粒逐个进行快速定量分析及分选的技术, 其借鉴了荧光标记技术、激光技术、单克隆抗体技术、计算机技术等, 能高速分析上万个细胞, 并能同时测量细胞的物理或化学性质, 如粒子的大小、体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等, 具有极高的统计精确度。如果同时结合免疫荧光抗原抗体检测技术, 鉴定效能更加强大[2]。Kempf等[31]将荧光探针技术和流式细胞术结合, 发现其可准确地从阳性血培养瓶中鉴定肠杆菌科细菌和白念珠菌。

综上所述, 自动化血培养仪主要的检测手段是监测培养瓶中CO2的产生和气压的变化, 可及时发出阳性报警。虽然血培养是诊断血流感染的金标准, 但时间依然过长, 无法满足临床需求。生物标志物检测虽然报告时间较短, 但特异性差, 无法区分血流感染和其他重症感染。分子生物学技术(FISH、PCR、基因芯片、质谱技术和流式细胞术)可以快速鉴定阳性血培养液中的细菌或真菌种类及耐药性, 其技术敏感性和特异性较高, 甚至可以直接从全血中鉴定微生物, 但生产成本亦高, 很多实验室无法承担。

The authors have declared that no competing interests exist.

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