引用本文
王明丽, 李智, 徐晋豫, 翁文浩, 许闪闪. miR-34a通过调控YY1抑制肾癌细胞的增殖及侵袭. 2012, 27(8): 635-640
WANG Mingli, LI Zhi, XU Jinyu, WENG Wenhao, XU Shanshan.. The inhibition of cell proliferation and invasion through miR-34a regulating YY1 in human renal carcinoma cell. Labratory Medicine, 2012, 27(8): 635-640  
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miR-34a通过调控YY1抑制肾癌细胞的增殖及侵袭
王明丽, 李智, 徐晋豫, 翁文浩, 许闪闪
同济大学附属上海市第十人民医院检验科,上海 200072

作者简介:王明丽,女,1984年生,技师,主要从事分子生物学检验工作。

通讯作者:李 智,联系电话:021-66306831。

摘要
目的

探讨miR-34a在肾癌组织中表达、miR-34a对人肾癌ACHN细胞增殖和侵袭的影响及调控机制。

方法

实时聚合酶链反应(PCR)检测miR-34a在20例肾癌及癌旁组织中的表达;采用脂质体转染法将miR-34a mimics转染入肾癌ACHN细胞中,试验分空白对照组、阴性对照组、miR-34a mimics 转染组。实时PCR检测转染24 h后miR-34a表达量;噻唑蓝(MTT)试验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;Transwell及Matrigel检测细胞侵袭能力;实时 PCR和蛋白质印迹(Western blot)技术检测转染后转录因子YY1表达水平。

结果

与癌旁组织相比,20例癌组织中miR-34a平均表达量为1.06±0.67,显著低于癌旁组织(1.62±0.83, P<0.01);转染后24 h, miR-34a mimics转染组的miR-34a表达量为157.04±13.01,较阴性对照组显著上调( P<0.01);miR-34a mimics转染组细胞增殖能力显著降低( P<0.01),细胞生长被阻滞在G0/G1期;细胞侵袭能力明显减弱( P<0.01);转染miR-34a mimics后 YY1基因在mRNA表达无明显变化( P>0.05),蛋白水平下调。

结论

miR-34a在肾癌中低表达,可能与肾癌的发生有关;miR-34a调控YY1的表达可能是抑制肾癌细胞生物活性的重要机制之一。

关键词: miR-34a; YY1; 细胞增殖; 侵袭; 肾癌
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)08-0635-06
The inhibition of cell proliferation and invasion through miR-34a regulating YY1 in human renal carcinoma cell
WANG Mingli, LI Zhi, XU Jinyu, WENG Wenhao, XU Shanshan.
Department of Clinical Laboratory,the Tenth People's Hospital of Tongji University, Shanghai 200072, China
Abstract
Objective

To investigate miR-34a expression in renal carcinoma cell and the inhibitory effect and regulating mechanism of miR-34a on the proliferation and invasion in human renal carcinoma ACHN cells.

Methods

The expressions of miR-34a in cancer and pericancerous tissues were detected by real-time polymerase chain reaction(PCR). ACHN cells were transfected with miR-34a mimics and there set blank control group, negative control group and miR-34a mimics group. The expression of miR-34a was measured by real-time PCR 24 h after transfection. The cell proliferation and cell cycle were determined by 5-dimethylthiazol-2-yl-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and flow cytometry. The invasive ability was examined by Transwell and Matrigel invasive assays. The mRNA and protein levels of YY1 were detected by real-time PCR and Western blot.

Results

The relative expression of miR-34a in cancer tissues (1.06±0.67) was significantly lower than that in pericancerous tissues (1.62±0.83, P<0.01). After transfection 24 h, an increase expression of miR-34a was noted in miR-34a mimics group (157.04±13.01) comparing with negative control group( P<0.01). Overexpression of miR-34a significantly inhibited the cell proliferation( P<0.01). The cell cycle was arrested at G0/G1 phases.Transwell and Matrigel invasive assays showed that the invasive ability of cells was significantly suppressed after transfection( P<0.01). YY1 gene had no mRNA expressions after transfection ( P>0.05).

Conclusions

The expression of miR-34a is low in renal carcinoma,and it may be correlated with tumorigenesis, partially through regulating YY1.

Keyword: miR-34a; YY1; Cell proliferation; Invasion; Renal carcinoma

肾癌占成人恶性肿瘤的2%~3%, 其中以肾透明细胞癌最多见[1]。由于肾透明细胞癌对化疗、放疗均不敏感, 免疫治疗也难以取得理想效果, 基因治疗已成为研究的热点。

microRNA是一种长约22个核苷酸的小分子RNA, 广泛存在于真核生物中, 是一组不编码蛋白质的短序列RNA。自2002年Calin等[2]首次报道microRNA异常与肿瘤相关后, 越来越多的研究显示microRNA参于肿瘤细胞发育、分化、凋亡和增殖等的调控, 在肿瘤发生和发展中起重要作用。miR-34a是一个进化保守的microRNA家族miR-34中的一员, 编码基因位于染色体1p36。有文献报道称miR-34a在人类胰腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤等众多恶性肿瘤中表达下调或缺失[3, 4, 5], 并认为其低表达促进肿瘤的发生。本研究观察miR-34a在肾透明细胞癌组织中的表达情况, 并使用miR-34a模拟物(miR-34a mimics)转染肾癌细胞株ACHN, 观察miR-34a对细胞增殖、侵袭能力的影响。由于通过软件预测得知转录因子YY1是miR-34a的靶基因, 本研究进一步分析了其对YY1的调控机制。

材料和方法
一、材料

人肾癌细胞株ACHN(ATCC号:CRL-1611TM)由上海市第十人民医院泌尿外科惠赠; DMEM培养液和胎牛血清购自Hyclone公司和Gibco公司; 逆转录和实时聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自TAKARA公司; LiPofectamine2000脂质体转染试剂和 Trizol购自美国 Invitrogen公司; 兔抗人YY1单克隆抗体购自Epitomics公司; 人miR-34a mimics、microRNA 阴性对照( miR Negative Control)由广州锐博生物公司合成; 实时 PCR引物由上海生物工程有限公司合成, 采用茎环法设计miR-34a和内参U6 RNA的逆转录和PCR的引物; 普通基因PCR以18S作为内源性参照, 见表1; Transwell小室购自BD 公司; Matrigel 购自Sigma公司。

表1 PCR引物序列、产物长度
二、肾癌标本miR-34a表达水平检测

标本取自上海市第十人民医院2008至2010年间手术切除的20例肾透明细胞癌及对应的癌旁组织, 所有标本于液氮冻存。Trizol裂解组织标本, 抽提总RNA, 逆转录获得各标本cDNA。取2 μ L cDNA为模板, 加入18 μ L PCR反应液[4 μ mol/L基因引物1 μ L, 2× 高灵敏DNA荧光染料(SYBR)Premix Ex Taq 10 μ L, 红色荧光染料ROX Dye(阳性参比信号, 50× )0.4 μ L, 双蒸水(ddH2O)6.6 μ L]。在ABI 7900实时荧光定量PCR仪上进行扩增, 反应条件为:95 ℃ 预变性1 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 共40个循环, 72 ℃ 5 min。

三、细胞培养及转染

ACHN细胞贴壁生长于DMEM培养液, 置于37 ℃、5% CO2、100%饱和湿度的培养箱中。转染前1 天将细胞以2× 105个/孔接种于6孔板中, 于24 h内当细胞融合达40%~60%时进行转染。采用阳离子脂质体 LiPofectamine 2000按试剂盒操作说明进行转染, 试验分3组:空白对照组(只加脂质体)、阴性对照组、miR-34a mimics 转染组。

四、荧光定量PCR 检测转染前后miR-34a 表达

Trizol 提取各试验组转染24 h后细胞总RNA, 逆转录获得各标本cDNA。荧光定量PCR, 以U6作为内参, 反应条件同上。

五、细胞增殖能力检测

转染5 h后消化细胞以1 000个/孔的密度接种于96孔板上, 每孔补足200 μ L培养基。各试验组每组设5个复孔。转染1、2、3和4 d后每孔加入20 μ L噻唑蓝(MTT), 孵育4 h, 吸弃原液加入150 μ L二甲基亚砜(DMSO)震荡10 min, 酶标仪检测490 nm波长处的吸光度(A)值, 各组求均值做生长曲线。

六、流式细胞术检测细胞周期的变化

取至少105个转染24 h后的各组细胞, 离心弃去上清, 用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后, 1× Binding buffer重悬细胞, 加入碘化丙锭(PI)5 μ L, 去RNA酶1.25 μ L, 裂解液(NP40) 0.25 μ L后检测细胞周期。

七、细胞侵袭迁移能力检测

1. Transwell迁移试验 转染5 h后消化细胞, 以含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的DMEM培养液重悬细胞, 5× 104个/小室接种于Transwell上室中, 补足培养基至100 μ L, 下室为500 μ L完全培养基, 20 h后取出将上室内面擦净, 乙醇固定, 结晶紫染色, 清洗, 拍照。33%冰醋酸溶解细胞, 酶标仪检测A573 nm值。

2. Matrigel侵袭试验 50 μ L Matrigel包被Transwell小室, 37 ℃ 1 h。转染5 h后消化细胞, 以含0.1% BSA的DMEM培养液重悬细胞, 1× 105个/小室接种于上室中, 最终保持上室内100 μ L培养基, 24 h后, 按Transwell试验进行后续操作。

八、荧光定量PCR、蛋白质印迹(Western blot)技术检测YY1 mRNA及蛋白表达

Trizol 提取各试验组转染48 h后细胞总RNA, 逆转录获得各标本cDNA后进行PCR扩增。以18S为内参, 反应条件同上。转染48 h后, 抽提总蛋白, 进行蛋白定量、电泳、转膜、封闭。加入兔抗人YY1抗体(1∶ 1 000)4 ℃孵育过夜, 再加入IRye700× 标记的羊抗兔和IRye800× 标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶ 1 000)孵育后, 以β -actin为内参, 用ODYSSEY数字显像系统采集信号。

九、统计学方法

应用SPSS 17.0软件包对试验数据进行统计, 试验结果以 x̅± s表示, 组织标本结果经对数转换后采用配对t检验比较组间miR-34a水平的差异, 单因素方差分析和q检验做多组间及两两比较。P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、肾癌及癌旁组织标本miR-34a表达情况

经实时PCR扩增得到各目的基因的Ct值, 以2-△ △ Ct相对定量的方法计算miR-34a与U6拷贝数的比值, 数据经对数转换后比较癌旁组和肾癌组之间的差异, 20例肾癌组织标本中miR-34a的表达量为1.06± 0.67, 明显低于癌旁组织(1.62± 0.83), 差异有统计学意义(t=6.87, P< 0.01)。见图1。

图1 肾癌及癌旁组织miR-34a的表达

二、转染miR-34a mimics后miR-34a表达变化

经实时PCR扩增得到各目的基因的Ct值, 以2-△ △ Ct相对定量的方法计算miR-34a与U6拷贝数的比值, 比较试验组和对照组之间的差异, 以

阴性对照组miR-34a表达量为1, miR-34a micmics转染组表达量为157.04± 13.01, 2组差异有统计学意义(t=20.768, P< 0.01); 而空白对照组为1.10± 0.17, 与阴性对照组间差异无统计学意义(t=1.01, P> 0.05)。

三、细胞增殖能力的变化

细胞增殖曲线显示, miR-34a mimics转染组细胞增殖速度明显降低, 转染后1、2、3、4 d细胞生长抑制率[(1-AmiR-34a/A阴性对照)× 100%]分别为9%、25%、37%和50%, 以转染后4 d最高, 与阴性对照组比较差异有统计学意义(t=40.53, P< 0.01), 而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(t=0.76, P> 0.05)。见图2。

图2 miR-34a mimics对ACHN细胞增殖的影响

四、流式细胞术检测转染后细胞周期的变化

转染miR-34a mimics后, 处于G0/G1期细胞数百分比增多, 阴性对照组为31.82± 0.97, 与miR-34a组(42.87± 0.40)相比差异有统计学意义(t=18.19, P< 0.01), 空白对照组为33.94± 1.62, 与阴性对照组组间差异无统计学意义(t=1.95, P> 0.05)。见图3。

图3 转染miR-34a mimics对ACHN细胞周期的影响

五、细胞迁移及侵袭能力的改变

转染miR-34a mimics后, miR-34a组(0.08± 0.004)的细胞穿过小室膜的细胞数较阴性对照组(0.168± 0.003)减少, 差异有统计学意义(t=26.2, P< 0.01)。空白对照组(0.63± 0.005)与阴性对照组比较则差异无统计学意义(t=1.31, P> 0.05)。见图4、5。

图4 转染miR-34a mimics对ACHN细胞迁移能力的影响(200× )

图5 冰醋酸溶解后细胞A值

转染miR-34a mimics后, miR-34a组(0.11± 0.007)穿过Matrigel基质胶的细胞数较阴性对照组(0.18± 0.005)明显减少, 差异有统计学意义(t=12.45, P< 0.01), 空白对照组(0.17± 0.005)与阴性对照组则差异无统计学意义(t=1.04, P> 0.05)。见图6、7。

图6 转染miR-34a mimics对ACHN细胞侵袭能力的影响(200× )

图7 冰醋酸溶解后细胞A值

六、转染后YY1 mRNA水平及蛋白水平变化

经实时PCR扩增得到各目的基因的Ct值, 以2-△ △ Ct相对定量的方法计算各基因与18 S拷贝数的比值, 比较试验组和对照组之间的差异。结果显示转染48 h后, YY1 mRNA水平无明显变化, 空白对照组为1.22± 0.089, 与阴性对照组(1.0± 0.015)相比差异无统计学意义(t=3.18, P> 0.05)。阴性对照组与miR-34a组(0.96± 0.043)相比差异也无统计学意义(t=0.98, P> 0.05)。Western blot结果显示, 转染48 h后, YY1蛋白表达水平明显降低。见图8、9。

图8 转染miR-34a mimics后YY1 mRNA表达的变化

图9 转染miR-34a mimics后YY1蛋白水平的变化

讨 论

肾癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤, 其治疗以外科手术切除为主, 但这给晚期肾癌的治疗带来一定的困难[1] 。近年来对基因治疗的应用研究逐渐成为肾癌新疗法的研究热点。目前已有多种基因治疗方案在临床上得到初步应用, 同时研究人员仍在不断找寻新的治疗基因。而microRNA的发现无疑为肿瘤基因治疗注入了新的活力。

microRNA通过抑制其靶基因, 在肿瘤的发生发展、增殖、凋亡、耐药以及转移等方面均发挥着重要作用, 有可能成为肿瘤治疗的新靶点。50%以上的microRNA编码基因位于与癌症有关的基因区或脆性位点内。在多种类型肿瘤细胞系和肿瘤中均可以检测到microRNA的异常表达。miR-34a的CPG岛甲基化沉默在前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌等多种细胞系中存在[6], 这表明miR-34a的失活可能与多种肿瘤的发生、发展相关, 提示其在上述肿瘤中发挥作用。目前对于miR-34a在肾癌细胞中的功能鲜有报道。因此, 研究miR-34a在肾癌中的功能并进一步探索其作用机制有重要意义。

miR-34a在肾癌中的表达如何?是否也参与肾癌的发生和发展?本试验结果显示, 与癌旁组织相比, miR-34a在肾癌中呈低表达, 表明miR-34a的低表达可能在肾癌发生和发展中起一定作用。最新研究证明在胶质瘤细胞U251中miR-34a充当着重要的抑癌基因的角色[7]。在肾癌中miR-34a是否也有着同样重要的作用, 本研究通过直接瞬时转染microRNA mimics对miR-34a功能进行了检测, 该法的优点在于化学合成microRNA简单、快捷, 可避免构建表达载体的步骤, 从而有效提高了特定microRNA的表达。本研究将miR-34a mimics转染入ACHN细胞内, 使miR-34a在肾癌细胞中表达上调, 并发现转染后细胞增殖明显受抑, 这种抑制效应在转染后1~2 d显现, 并持续4 d以上, 且细胞被阻滞于G0/G1期, 有丝分裂受到抑制, 说明miR-34a在促进细胞生长分化方面可能起重要作用。本研究结果还显示, miR-34a mimics 转染组中细胞侵袭迁移能力明显减弱, 提示miR-34a mimics抑制细胞侵袭能力。

我们通过mirBase、TargetScan和PicTar等生物信息学网站分析miR-34a可能的靶基因, 且Chen等[8]已通过荧光素酶报告系统证实YY1是miR-34a的直接靶基因, miR-34a直接与YY1的3'非编码区结合来调控其翻译。YY1具有促进肿瘤细胞增殖、分化和转移的作用, 在前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、骨肉瘤等肿瘤中都显著高表达, 揭示了YY1在肿瘤发展中的重要作用[9, 10]。其在肾癌中的功能目前未见报道, 本课题组前期工作证实了YY1在肾癌细胞中扮演癌基因的作用。利用Western blot技术, 本研究检测出转染miR-34a mimics后ACHN细胞YY1蛋白表达量明显降低, 而mRNA水平无明显变化, 提示在肾癌细胞中miR-34a是在转录后水平对YY1进行调控, 进而起到抑癌的作用。

综上所述, 本试验初步观察到miR-34a的低表达可能是肾癌发生中的重要事件, 在肾癌发生和发展过程中可能具有重要作用, 并初步显示了miR-34a的抑癌作用有可能部分地通过调控YY1来实现。miR-34a有望成为肾癌的诊断和进展的分子标志物, 也可能是肾癌基因治疗的一个有效靶点。然而, 包括YY1在内的这些靶基因及具体、精确的作用机制还有待于进一步的研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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