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王建华, 王卫国, 马黎丽, 王伟. 阜阳市慢性乙型肝炎病毒感染者HBV基因型调查. 2012, 27(7): 611-613
  
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阜阳市慢性乙型肝炎病毒感染者HBV基因型调查
王建华, 王卫国, 马黎丽, 王伟
阜阳市人民医院检验科,安徽 阜阳 236006

作者简介:王建华,男,1968年生,学士,副主任技师,主要从事分子生物学检验。

通讯作者:王卫国,联系电话:0558-2515331。

基金:阜阳市卫生局科研基金(2010Y010)
摘要
目的

了解阜阳市慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者HBV基因型分布状况。

方法

选择165例HBV DNA阳性的慢性HBV感染者,采用型特异性聚合酶链反应(PCR)检测HBV基因型。

结果

165例慢性HBV感染者中HBV基因型B型46例(27.9%)、B/C混合型29例(17.6%)、C型90例(54.5%),未发现其他基因型。

结论

阜阳市慢性HBV感染者基因型为B、B/C和C型,其中基因C型是主要流行株。

关键词: 乙型肝炎病毒; 基因型; 聚合酶链反应
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)07-0611-03

在中国, 乙型肝炎病毒(HBV)是感染最为广泛的病原体之一, 大约有8%~10%人群为HBV感染, 其中慢性乙型肝炎患者约3 000万。目前根据HBV全基因组序列或S基因序列的差异, 将HBV分为A~H 8种基因型, HBV基因型分布具有明显的地域性和民族分布特征, 亚洲主要以A~D型为主, 而我国HBV基因型分布以B、C型为主, 其中南方主要以B型为主, 而北方主要以C型为主[1, 2, 3, 4, 5, 6]。HBV基因型结构和功能的不同, 可影响疾病的严重性、病情的转归、e抗原血清学转换以及对治疗的反应性。近年来, 由于人员流动频繁以及阜阳市处于我国中部地区, 了解慢性乙型肝炎患者HBV基因型分布情况对本市乙型肝炎的防治具有重要意义。为此, 我们应用型特异性聚合酶链反应(PCR)技术对阜阳市慢性乙型肝炎患者的HBV基因型进行了调查。

材料和方法
一、材料

1.研究对象 选择2011年5月至2011年12月阜阳市人民医院临床确诊的慢性乙型肝炎感染者165例, 其中男107例、女58例, 年龄10~71岁, 诊断标准符合2000年第10次全国传染病与寄生虫病学会和肝病学分会联合修订的病毒性肝炎防治方案。受检患者空腹采集静脉血5 mL, 收集于无抗凝剂的无菌干管中, 2 700× g离心10 min分离血清, -80 ℃保存备用。

2. 主要试剂和仪器 HBV DNA荧光定量检测试剂盒(广州中山达安基因有限公司); 血清DNA提取液试剂盒(艾康生物技术有限公司); 即用型PCR试剂盒和DNA marker(天恩泽基因科技有限公司); 引物由上海生工公司合成。

二、方法

1. 血清DNA提取 取50μ L血清加入50μ L DNA提取液混匀后, 与金属浴100 ℃煮沸10 min, 13 000× g离心10 min, 取上清4 μ L用于型特异性PCR的第1轮扩增。

2. 型特异性PCR检测HBV基因型 利用型特异性PCR技术检测HBV基因型, 引物序列见表1。第1轮PCR反应条件:取上述血清DNA提取物4 μ L, 引物0.5 μ L, PCRmix 20 μ L , 补充水至40 μ L, 95 ℃预变性10 min, 94 ℃ 20 s, 55 ℃ 20 s, 72 ℃ 1min, 共40个循环, 72 ℃稳定5 min。第2轮PCR条件:取第1轮PCR产物1 μ L, 引物各0.5 μ L, PCRmix 20 μ L, 补足水至40 μ L, 95 ℃预变性10 min, 94 ℃ 20 s, 58 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s, 共20个循环, 94 ℃ 20 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s, 共20个循环, 72 ℃稳定7 min。分别取扩增产物10 μ L于琼脂糖凝胶电泳分析, A、B、C、D、E、F 6种HBV基因型PCR扩增片段的长度分别为68、122、281、119、167和97 bp。对于不能检出的基因型, 用第一轮PCR产物测序分析。

表1 HBV PCR基因分型的引物及其序列

三、统计学方法

采用SPSS11.0统计软件进行分析, 计数资料采用χ 2检验。P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果

165例慢性乙型肝炎患者共检测出3种基因型:B型46例, 占27.9%; B/C混合型29例, 占17.6%; C型90例, 占54.5%, 未发现其他基因型。基因C型比例高于其他2型(P< 0.05)。随机选取基因B和C型各5份样本送往达安公司进行S序列测序, 两者结果完全符合。图1为HBV基因型分析电泳结果。

图1 HBV基因型分析的PCR电泳结果

讨 论

目前几种检测HBV基因型方法中, 型特异性引物PCR是较为易行和准确的分型方法[7, 8], 本实验随机抽取的10例样本, 通过对S区序列测定(HBV基因型检测的“ 金标准” ), 两者完全符合, 也证实此方法的可靠性。

HBV基因型分布呈一定的地域性, 我国主要存在A、 B、C和D 4种基因型, 基因A型零散存在, 基因D型主要存在新疆等少数地区, 基因B和C型是我国的主要基因型, 其他HBV基因型尚未见相关报道。目前关于本省HBV基因型分布特征, 少有报道[9, 10]。我们选择型特异性引物检测本市慢性乙性肝炎病毒感染者HBV的基因型, 对本地的流行病学调查和乙肝的防治有着非常重要的意义, 因为不同的基因型可引起不同的血清学反应模式、致病性、毒力和治疗反应性。本研究发现, 本市慢性乙型肝炎感染者HBV基因型存在C、B、BC混合型, 而且基因C型的比例高于其他2型, 为优势基因型, 这与王其亮等[9]研究结果较为一致, 但本市有无其他HBV基因型存在, 需扩大样本量, 进一步研究。有研究发现, 基因C型与基因B型HBV感染者相比, HBV特异性细胞毒性T细胞较低, 导致HBV感染难以清除[11], 感染基因C型的慢性乙肝患者病毒载量水平高, 对抗病毒治疗反应性较差, 血清学转换率也较低, 各种原因导致基因C型的HBV感染者更易发生肝纤维化和肝细胞恶性变[4, 6, 10, 12]。同时, 我们发现本市的慢性乙肝患者存在一定比例的B/C混合型, 这可能是慢性HBV感染者免疫功能低下获得的二次感染, 关于此混合基因型在免疫应答、治疗疗效和疾病的转归等许多方面尚缺乏系统性的研究, 也是我们下一步研究的方向。

总之, 阜阳市慢性乙型肝炎基因型分布以B、C或B/C混合型为主, 其中基因C型比例较高, 符合我国北方城市HBV流行病学状况, 本研究为本地的乙型肝炎防治和发病机制的认识, 提供了一定的依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

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