引用本文
蒋黎敏, 徐翀, 傅启华. 骨髓中CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞与儿童急性B淋巴细胞白血病的相关性研究 . 2012, 27(7): 601-605
JIANG Limin, XU Chong, FU Qihua. Research on correlation of bone marrow CD4+CD25highFoxp3+ regulatory T cells with childhood acute B lymphoblastic leukemia . Labratory Medicine, 2012, 27(7): 601-605  
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骨髓中CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞与儿童急性B淋巴细胞白血病的相关性研究
蒋黎敏1, 徐翀2, 傅启华1
1.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科,上海 200127
2.上海市临床检验中心免疫室,上海 200126

作者简介:蒋黎敏,男,1978年生,学士,主管技师,主要从事医学检验工作。

摘要
目的

通过检测急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿骨髓中叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3) mRNA的表达及CD4+细胞中调节性T细胞(Treg)比例,探讨Treg与儿童B-ALL发生及预后的关系。

方法

用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测10名正常儿童、35例初发B-ALL患儿及68例临床缓解患儿骨髓中Foxp3 mRNA水平;用流式细胞术检测上述骨髓标本中CD4+CD25high Foxp3+ Treg的比例;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测骨髓中细胞因子白细胞介素10(IL-10)的表达情况。

结果

骨髓中Foxp3 mRNA表达水平在B-ALL初发患儿组是对照组的4.44倍,微小残留病(MRD)阳性组是阴性组的2.39倍;B-ALL初发患儿骨髓中Treg占CD4+T淋巴细胞的比例[中位数( M)=12.77%]较对照组( M=8.09%)增高,差异具有统计学意义( P<0.01);MRD阳性组 Treg比例( M=14.74%)与MRD持续阴性组( M=11.30%)比较,差异具有统计学意义( P<0.05)。治疗后MRD阳性组骨髓中IL-10水平[(24.69±11.73)pg/mL]显著高于MRD持续阴性组[(9.19±5.82) pg/mL, P<0.05]。

结论

B-ALL初发和MRD阳性患儿骨髓中Foxp3 mRNA水平和Treg比例显著增高,且骨髓中IL-10水平与Treg的比例变化趋势相一致。Treg可作为评价B-ALL患儿预后和复发的指标,Treg可能是通过分泌抑制性细胞因子IL-10而发挥其抑制作用。

关键词: 调节性T细胞; 叉状头/翅膀状螺旋转录因子; 急性B淋巴细胞白血病; 微小残留病
中图分类号:R446.63 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)07-0601-05
Research on correlation of bone marrow CD4+CD25highFoxp3+ regulatory T cells with childhood acute B lymphoblastic leukemia
JIANG Limin1, XU Chong2, FU Qihua1
1.Department of Clinical Laboratory, Shanghai Children Medical Center, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200127, China
2. Department of Immunology Laboratory, Shanghai Center for Clinical Laboratory, Shanghai 200126, China
Abstract
Objective

To analyze the forkhead box protein 3 (Foxp3) mRNA expression and the CD4+ regulatory T cells (Treg) frequency in the bone marrow of childhood acute B lymphoblastic leukemia (B-ALL), and to investigate the relationship between Treg and the development and prognosis of childhood B-ALL.

Methods

The levels of Foxp3 mRNA were detected in 35 children with B-ALL, 68 patients with remission and 10 healthy controls by real-time polymerase chain reaction (PCR). The CD4+ CD25high Foxp3+ Treg were identified by flow cytometry. The interleukin-10 (IL-10) expression level in bone marrow was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Results

The level of Foxp3 mRNA expression in B-ALL group was 4.44 times higher than that of control group. In minimal residual disease (MRD) positive group, it was 2.39 times higher than that in MRD negative group. The percentage median ( M) of Treg in CD4+T cells was 12.77% in B-ALL group, which was significantly higher than that in control group (8.09%, P<0.01). In addition, Treg frequency in MRD positive group ( M=14.74%) was significantly different from that in MRD continuously negative group ( M=11.30%, P<0.05).The level of IL-10 in MRD positive group was (24.69±11.73)pg/mL, which was higher than that of MRD continuously negative group[(9.19±5.82)pg/mL, P<0.05].

Conclusions

The frequency of Treg and Foxp3 mRNA are significantly elevated in patients with childhood B-ALL and patients with positive MRD, and the IL-10 level in bone marrow is consistent with the frequency of Treg. Treg can be used to evaluate the prognosis and relapse of childhood B-ALL, and may play its role by secreting inhibitory cytokine IL-10.

Keyword: Regulatory T cell; Forkhead box protein 3; Acute B lymphoblastic leukemia; Minimal residual disease

白血病是儿童最常见的恶性肿瘤之一, 其病因和发病机制至今仍未完全明了。目前有研究认为机体的免疫状态在白血病的发生、发展及复发中具有重要作用。机体的免疫系统受多重调节, 其中调节性T细胞(reguratory T cell, Treg)发挥重要的免疫负调节作用, 可抑制自身反应性T细胞的激活以维持免疫自稳状态, 但同时也可抑制肿瘤特异性T细胞发挥有效的抗肿瘤应答。相关研究发现在肺、卵巢、胃肠道及乳腺等实体恶性肿瘤患者外周血中或肿瘤局部CD4+CD25high叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)+Treg增多, 并且与患者的生存率和预后呈负相关[1], 提示Treg的免疫抑制作用与实体肿瘤的发生、发展有一定的关系。急性白血病为非实体肿瘤, Treg在此类疾病中所发挥的作用及其相关机制, 国内外鲜见报道[2, 3, 4]。本研究通过比较急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)初发患儿及治疗后微小残留病(MRD)阳性和阴性患儿骨髓中Foxp3 mRNA的水平及Treg比例变化, 评估Treg在该病的发病及预后中的作用。

材料和方法
一、材料

1. 标本来源 103例B-ALL患儿均为上海儿童医学中心血液肿瘤科门诊或住院患儿, 男54例, 女49例, 年龄3~11岁。初发患儿35例, 68例为B-ALL治疗中或预后监测患儿。10份健康骨髓对照标本来源于上海儿童医学中心胸外科手术患儿, 男5例, 女5例, 年龄2~10岁。

2. 试剂和仪器 (1)试剂:人Treg FACS kit(美国eBioscience公司), 反转录试剂盒(ABI公司), 荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒(Invitrogen公司); 总RNA提取试剂(Trizol, Invitrogen公司), 焦碳酸二乙酯(DEPC, Invitrogen公司), 人白细胞介素10(IL-10)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(R& D公司)。人Foxp3引物序列:Sense:5'-ATCCGCCACAACCTGAGTCT -3', Anti-sense, 5'-TGCGGAACTCCAGCTCATC-3', 目的片段大小为91 bp。β -actin引物序列:Sense, 5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3', Anti-sense, 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3', 目的片段大小为205 bp, 均由上海生工生物有限公司合成。荧光抗体CD25-藻红蛋白(PE)、CD4-多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)、CD3-别藻蓝蛋白(APC)和Foxp3-异硫氰酸荧光素(FITC)均购自美国BD公司; (2)仪器:FACS Calibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司); LightCycler荧光PCR仪(Roche公司); ST-36WT酶标仪(上海科华公司)。

二、方法

1.标本采集 采集新鲜骨髓2 mL, 肝素抗凝, 6 h内完成检测。

2.Treg染色(Foxp3-FITC/CD25-PE/CD4-PerCP/CD3-APC) 参照试剂说明书在试管中分别加入CD25-PE、CD4-PerCP荧光抗体各20 μ L, CD3-APC荧光抗体5 μ L, 加稀释骨髓50 μ L (每微升骨髓中含有约105个白细胞)。室温下避光温育15 min。加磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次, 加1 mL破膜液, 4 ℃避光孵育1 h。用洗涤液清洗3次, 加兔血清4 ℃避光封闭15 min, 随后加10 μ L Foxp3-FITC, 4 ℃避光温育30 min。PBS洗涤2次后上机检测。在流式点图上选取CD3+细胞群, 用以去除CD4+单个核细胞对分析过程的干扰, 在表达CD4+和CD25high的细胞中, 读取CD4+T淋巴细胞中Treg的比例。

3.总RNA抽提及实时定量PCR 提取方法参照试剂盒说明书进行, 1× 106个细胞中加入1 mL Trizol裂解细胞, 然后加入200 μ L氯仿, 混匀, 室温静置15 min后12 000× g高速低温离心20 min; 小心将上层水相移至1.5 mL EP管中, 加入500 μ L异丙醇, 振荡混匀。室温放置30 min沉淀RNA, 12 000× g高速低温离心10 min; 小心弃去上清液, 再在EP管中加入1 mL 75%乙醇, 振荡片刻, 8 000× g低温离心5 min; 小心弃去上清液, 室温静置5~10 min使RNA沉淀、干燥, 用去RNA酶(RNase)水溶解。将Trizol抽提的细胞总RNA反转录进行cDNA第1链的合成:1~5 μ g总RNA中加1 μ L 寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸街头引物(oligo dT-adaptor primer), 70 ℃ 5 min, 于冰上加入5× 缓冲液3 μ L、dNTP 2 μ L、RNasin 0.5 μ L、AMV反转录酶1 μ L, 加水至总体积15 μ L, 42 ℃延伸60 min后, 70 ℃ 10 min。然后以cDNA为模板扩增Foxp3和β -actin。荧光定量PCR反应体系:热启动荧光定量PCR预混液10 μ L, 上游引物(50 pmol/μ L)0.2 μ L, 下游引物(50 pmol/μ L)0.2 μ L, 无菌去离子水7.6 μ L, 上述逆转录后的cDNA 2 μ L; 总体积为20 μ L。扩增条件设置93 ℃预变性2 min; 93 ℃变性15 s, 60 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s, 40个循环, 每个循环延伸后收集一次荧光, 分析模式设定为定量分析; 93 ℃变性15 s, 72 ℃延伸1 min, 最后设定温度93 ℃, 温度变化速率为0.1 ℃/s, 连续监测荧光, 进行扩增曲线分析。结果计算:用相对定量的研究方法分析试验结果, Foxp3/β -actin比值采用2-△ Ct方法计算。

4.IL-10检测 采用定量ELISA, 骨髓标本离心后取上清置-20 ℃冰箱保存待测。按试剂盒说明进行检测。已包被抗体的酶标板中加100 μ L标本, 室温孵育1 h后洗板3次, 加入生物素标记检测抗体100 μ L, 室温孵育1 h后洗板3次, 加入亲和素标记辣根过氧化物酶100 μ L, 室温温育30 min后洗板7次, 加入底物液100 μ L, 室温避光15 min后加入2 mol/L H2SO4终止, 450 nm波长检测吸光度(A)值。

三、统计学方法

用Cellquest软件(Version3.2)收集、分析数据并做图。偏态分布数据以中位数(M和范围)表示, 组间数据比较用秩和检验, 正态分布数据以 x̅± s表示, 组间数据比较用t检验, P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、B-ALL初发患儿及治疗后骨髓中Foxp3 mRNA的表达水平

B-ALL初发患儿Foxp3 mRNA的表达水平(2.92± 1.03)是对照组(0.66± 0.16)的4.44倍, 两者差异有统计学意义(P< 0.05); 临床治疗后Foxp3表达下降, MRD阳性组降低不明显(2.34± 0.87), 而MRD阴性组降低至0.98± 0.41, 接近正常对照组, MRD阳性组是阴性组的2.39倍, 两者差异有统计学意义(P< 0.05)。见表1。

表1 B-ALL初发患儿和治疗后骨髓中Foxp3 mRNA的表达水平
二、B-ALL初发及治疗后患儿骨髓中Treg比例变化

B-ALL初发患儿骨髓CD4+细胞中的Treg比例[M=12.77%(6.65%~19.69%)]明显高于对照组[M=8.09%(6.58%~8.98%)], 见图1a; 治疗后MRD阳性组Treg比例[M=14.74%(7.63%~25.65%)]明显高于MRD阴性组[M=11.30%(7.08%~14.42%), P< 0.05], 见图1b。

图1 B-ALL初发及治疗后患儿骨髓中Treg的比例变化

三、B-ALL患儿治疗前、后骨髓中IL-10的表达水平

B-ALL初发患儿骨髓中IL-10的表达水平显著高于对照组(P< 0.05)。B-ALL患儿经治疗后骨髓中IL-10水平与治疗前相比明显下降, MRD阴性组下降至(9.19± 5.82) pg/mL, 接近健康对照组, 而MRD阳性组仍为(24.69± 11.73) pg/mL, 显著高于MRD阴性组(P< 0.05), 见表2。细胞因子IL-10水平与Treg的比例变化趋势相一致。

表2 B-ALL初发患儿和治疗后骨髓中IL-10的表达水平
讨 论

正常情况下机体存在对肿瘤发生的免疫监视功能, 但部分肿瘤细胞能成功逃避免疫系统的抗肿瘤免疫监视作用进而导致肿瘤发生, 所以打破肿瘤免疫耐受是肿瘤免疫治疗的关键。在白血病患儿体内残存的微量白血病细胞是导致肿瘤复发的根源。当白血病细胞达到1× 103左右时, 化疗药物不再发挥作用, 此时主要依靠机体自身的免疫系统来清除MRD[5]。因此白血病患儿机体的免疫状态与其预后密切相关。

Treg是一组具有免疫调节(或免疫抑制)作用的细胞群, 是健康个体T淋巴细胞库的组成成分, 表达白细胞介素2(IL-2)受体α 链(CD25), 通常占CD4+T淋巴细胞5%~10%。有学者认为Treg是机体免疫系统的一个重要调控者, 可通过细胞接触依赖机制或分泌抑制性细胞因子依赖机制主动抑制自身反应性T淋巴细胞的活化, 在机体的抗肿瘤免疫中发挥重要作用[6]。在该群细胞中大多数表达Foxp3, 故通常将表达Foxp3作为Treg的一个标志。更为重要的是, Foxp3在Treg的发育和功能维持中发挥 “ 总开关” 的作用。将小鼠和人的Foxp3基因突变后可引起Treg缺失, 导致严重的自身免疫紊乱。除此之外, 异位表达Foxp3分子可使CD4+CD25-T细胞获得全部或部分Treg的表型和功能[7]。因此对Foxp3表达水平的监测具有重要意义。本研究首先通过实时定量PCR分别对初发B-ALL患儿及治疗后MRD阴性和阳性患儿骨髓中Foxp3 mRNA的表达水平进行比较, 发现B-ALL初发患儿Foxp3 mRNA水平明显高于对照组, 该结果与李爱华等[2]的研究结果一致; MRD阳性患儿Foxp3表达明显高于MRD阴性患儿, 提示Foxp3可能参与儿童B-ALL的发生, 并可能在治疗后对骨髓中白血病细胞的清除具有抑制作用。

Foxp3分子曾被认为其表达严格限制于T细胞系, 近来有研究报道Foxp3也表达于胰腺癌细胞, 并使胰腺癌细胞获得部分Treg的表型和功能[8]。为了进一步证实Treg在B-ALL患儿及MRD阳性患儿体内的比例, 我们选用CD4、CD25和Foxp3指标界定Treg, 用流式细胞术检测骨髓中Treg的比例, 结果提示对照组骨髓中Treg比例低于B-ALL初发患儿组; 治疗后, MRD阳性组Treg比例高于MRD阴性组, Treg的比例与Foxp3 mRNA的表达水平的变化趋势相一致。

Treg可通过细胞接触和分泌免疫抑制性细胞因子等多种方式发挥免疫抑制功能。目前已研究证实的有如下几种途径:(1)通过活化穿孔素或溶酶体B途径; (2)分泌IL-10和转化生长因子β 1(TGF-β 1)抑制性细胞因子[9, 10]; (3)上调抗原提呈细胞(APC)吲哚胺-2, 3-加双氧酶的表达[1, 11]; (4)Treg表达的CD39和CD73属于二磷酸水解酶家族, 分解产生的核苷、腺苷、对效应细胞具有极强的抑制作用[12, 13]。本研究对抑制性细胞因子IL-10的水平分析, 结果提示MRD阳性组血中IL-10的水平明显高于MRD持续阴性组, 且初发B-ALL患者IL-10水平也高于对照组, 与骨髓中Treg的变化相一致, 提示Treg可能通过分泌抑制性细胞因子而对效应细胞发挥抑制作用, 但尚需通过阻断等试验进一步验证。B-ALL患儿骨髓中Treg在疾病中对效应细胞如何发挥其抑制作用, 也还有待于进一步研究证实。本研究的不足之处在于只分析了IL-10这一种细胞因子, 在今后的试验中, 还应分析TGF-β 1等其他的细胞因子, 以此更全面的探讨Treg对B-ALL患儿T细胞抑制作用的方式。

本研究结果提示, 在B-ALL患儿骨髓中Treg数量明显高于对照组, 且MRD阳性患儿较阴性者Treg在骨髓中所占百分比明显增加, Foxp3 mRNA的水平与Treg变化相一致。其骨髓中抑制性细胞因子IL-10水平也与Treg的变化趋势相一致, 提示Treg可能是通过分泌抑制性细胞因子IL-10发挥抑制作用。因此对儿童白血病及其治疗后患儿骨髓中Treg的监测, 可用于判断其预后, 同时该研究也为白血病患儿的治疗提供了新的思路。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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