1.仪器 Bio-Rad D-10 HbA1c分析仪(简称D-10)及配套试剂(美国伯乐生命医学产品有限公司)。Arkray ADAMS^TMA1c HA-8160全自动HbA1c分析仪(简称HA-8160)及配套试剂(日本爱科来国际贸易有限公司)。TOSOH HLC-723 G7全自动HbA1c分析仪(简称HLC-723 G7)及配套试剂(日本东曹株式会社)。

2.试剂 校准品为3种仪器配套校准品。质控品为Bio-Rad低、高2水平非定值HbA1c质控品Q1、Q2(美国伯乐生命医学产品有限公司)。

3.样本 卫生部北京医院内分泌实验室收集84份抗凝新鲜全血, 用冻存管分装, 每管200 μ L, 储存于-80 ℃冰箱中。

1.校准 所有HbA1c分析仪检测前均用配套校准品校准, 以确保检测结果的准确性, 此后的实验中不再进行校准。

2.样本处理 样本处理时将全血样本从冰箱中取出溶解后, 从每一份样本中吸取3份5 μ L全血, 分别用D-10、HA-8160、HLC-723 G7 3种仪器的配套稀释液以1∶ 300、1∶ 200、1∶ 200的比例稀释并混合均匀, 上机测定。

3.测定过程 每日开机后, 分别采用3种仪器以稀释模式测定Bio-Rad质控品, 确认室内质控合格后, 以相同模式测定临床样本, 每管测定1次, 以所得数据作为该样本的测定结果, 连续测定13个工作日, 选取其中无变异血红蛋白的58份样本测定结果作为有效测定结果。

4.数据处理 (1)分别记录每种仪器测定Q1、Q2 的室内质控结果, 使用Levene's方法进行方差齐性检验; 判定方差相等后对室内质控数据进行单因素方差分析, 对各仪器间的室内质控结果进行比较; (2)以X、Y、Z分别代表D-10、HA-8160和HLC-723 G7 3种仪器, 记录其临床样本测定结果(X_i、Y_i、Z_i), 计算每2种仪器测定结果的差值(Y_i-X_i、Z_i-X_i、Z_i-Y_i), 并对结果进行方差齐性检验和单因素方差分析, 考察3种仪器测定临床样本差异是否有统计学意义; (3)进行仪器之间的离群点检查, 计算2种仪器测定结果间绝对差值∣X_i-Y_i∣、∣X_i-Z_i∣、∣Z_i-Y_i∣, 超出该绝对值平均数4倍时, 则判断该测定值为离群点; (4)以Y_i对X_i、Z_i对X_i、Z_i对Y_i做散点图, 计算每2种仪器间的直线回归方程, 以观察每2种仪器测定结果之间的相关性; (5)以(Y_i-X_i)对X_i、(Z_i-X_i)对X_i、(Z_i-Y_i)对Y_i做偏差图, 以观察每2种仪器测定结果之间的偏差; (6)对3种仪器测定患者样本HbA1c结果进行预期偏差估计。

对每种仪器测定Q1、Q2质控品结果使用Levene's方法进行方差齐性检验, Q1、Q2的L值分别为0.502 4、0.456 2, 均< F_{0.05(2, 36)}=3.26, P> 0.05, 可以认为不同仪器测定同一质控品结果的方差相等。分别对Q1、Q2的室内质控数据进行单因素方差分析, 3种仪器测定Q1的室内质控结果差异有统计学意义(P=7.98× 10^-11), 测定Q2的室内质控结果差异无统计学意义(P=0.07)。

分析临床样本测定结果(X_i、Y_i、Z_i), 2种仪器间偏移(X_i-Y_i、X_i-Z_i、Z_i-Y_i)最小为-0.06% HbA1c, 最大为0.70% HbA1c。对3种仪器测定临床样本的结果进行方差齐性检验, L=0.001 2, < F_{0.05(2, 171)}=3.06, P> 0.05, 可以认为不同仪器测定同一临床样本结果的方差相等。对结果进行单因素方差分析, P=0.328, 说明3种仪器测定结果差异无统计学意义, 可比性较好。

第40号样本分别采用D-10和HA-8160测定时, 其结果间差值的绝对值即绝对偏差为0.72% HbA1c, 超过了差值绝对值均值的4倍(0.70% HbA1c)。用相对绝对差值进行另外的计算, 得到相对的绝对偏差为0.10% HbA1c, 等于相对的绝对偏差界限(0.10% HbA1c)。因此, 可以认为仪器间无离群点。

对每2种仪器测定临床患者样本的结果作散点图。D-10、HA-8160测定结果间的回归方程为Y =0.963X+ 0.179, r² =0.976; D-10、HLC-723 G7测定结果间的回归方程为Y =0.968X+0.523, r²=0.982; HA-8160、HLC-723 G7测定结果间的回归方程为Y= 0.987X + 0.480, r² =0.969。每2种仪器间的相关系数均> 0.95, 说明结果分布范围符合要求。每2种仪器的散点图见图1。

图1

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	图1 3种仪器测定临床样本结果的相关图

由于比对方法不是参考方法, 因此用2种仪器测定结果的差值相对于2种仪器测定结果的均值作图, 见图2。在4.9%~11.4% HbA1c范围内, 同1份样本分别用D-10、HA-8160测定的偏差在-0.37%~0.72% HbA1c之间, 呈随机分布, 且有明显倾斜趋势, 即随(X_i+Y_i)/2的增加, (Y_i-X_i)值增加; HLC-723 G7、HA-8160测定的偏差在-0.1%~0.8% HbA1c之间, 呈随机分布, 且有明显倾斜趋势, 即随着(X_i+Z_i)/2值的增加, (Z_i-X_i)值减小; 用HLC-723 G7、HA-8160 2种仪器测定的偏差在-0.13%~1.12% HbA1c之间呈随机分布, 无明显倾斜趋势, 但截距明显, 且(Z_i-Y_i)多为正值。

图2

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	图2 3种仪器测定临床样本的结果偏差图

分别以X_i、Y_i、Z_i代表D-10、HA-8610和HLC-723 G7 3种仪器的HbA1c结果, 对其进行预期偏差评估, 结果见表1。

表1

表1

表1 3种仪器测定患者样本结果之间的偏差评估 测定值(%HbA1c) 百分偏差(%) Xi Yi Zi Xi、Yi Yi、Zi Xi、Zi 4.9 4.9 5.3 0 7.3 7.0 6.5 6.4 6.8 -0.9 5.7 4.7 7.5 7.4 7.8 -1.3 4.9 3.6 11.4 11.2 11.6 -2.1 2.8 1.4

表1 3种仪器测定患者样本结果之间的偏差评估

HbA1c作为糖尿病患者进行血糖控制和疗效考核的有效检测指标, 在临床中得到了广泛的使用, 2009年美国糖尿病协会将其列入糖尿病首选的诊断标准^[4]。对其应用也作了明确的规定:即所有糖尿病患者均应常规测定HbA1c。

目前实验室常用的HbA1c的测定方法包括离子交换色谱、亲和色谱法和免疫分析。其中离子交换HPLC已被美国、瑞典及日本等国家将其作为HbA1c标准化参考系统的参考方法^[5]。采用HPLC原理的全自动HbA1c分析仪, 以其快速、简便、精巧、准确等特点, 受到越来越多用户的欢迎。

本研究对3种基于HPLC原理的HbA1c分析仪的室内质控结果进行了初步比对。结果显示, 在仪器维护得当的情况下, 每种仪器的长期稳定性均较好, 但是3种仪器测定低浓度质控品结果之间差异有统计学意义, 而测定高浓度质控品则无明显差异。该质控品为冻干品, 属于制备样本, 和人血基质不同。因此使用不同仪器测定而得到不同结果很可能是由于样本的基质效应造成的。这也进一步说明, 该种样本只能用做仪器的室内质控, 用以控制仪器测定结果的精密度水平, 而不能用作仪器间测定结果的比对和偏差评估。

本研究中临床患者新鲜冰冻全血样本在3种仪器之间测定值的比对结果显示, 在常见的正常生理及病理范围内, 仪器间测定结果的偏差绝对值不超过0.5% HbA1c, 属于临床可接受的范围。

然而, 2011年全国HbA1c室间质量评价结果统计表显示, 相同仪器的组内变异系数(CV)在3.33%~15.44%之间, 多数仪器组内CV> 5.0%, 其中基于离子交换HPLC的仪器组内CV相对较小, 而所有仪器组的CV为9.55%。产生仪器间偏差的原因主要有以下几个可能:离子交换色谱法可能受到胎儿血红蛋白(HbF)、变异血红蛋白(HbS、HbC、HbE和HbD)以及衍生化血红蛋白(甲酰化血红蛋白)等的干扰影响, 这要视离子交换柱的分离能力而定。另外, 仪器状态也是影响测定结果因素之一, 仪器长时间不使用, 色谱柱又没有经过特别保护可能会对填料造成损坏, 造成样本各组分分离不完全, 影响测定结果。因此, 在样本量不大的情况下应该定期对色谱柱进行维护, 或重新灌注校准后再使用。除此之外, 造成检测结果差异的最重要原因就是仪器校准结果不同, 从而对检测结果产生偏差。

这一问题说明, 我国HbA1c测定标准化工作迫在眉睫。标准化工作的核心问题就是建立参考系统。卫生部临床检验中心已经在这方面做了的一些工作, 在承担的863课题中, 我们建立了液相色谱串联质谱测定HbA1c的候选参考方法, 研制了国内首批人血红蛋白溶液中HbA1c标准物质, 以常规方法研究了稳定性、均一性, 均达到国外同类产品质量水平, 申请国家一级标准物质已通过终审。另外, 我们近几年开始发放冰冻人血HbA1c室间质评样本, 排除了基质效应的影响, 为更有效地评价室间质评结果提供了充分条件。目前, 我们正致力于参考实验室网络的建立, 有望在近几年内, 在全国各实验室的配合下, 不断提高临床实验室HbA1c检测结果的可靠性, 为临床提供更为准确有效的数据。