2010年1月至9月在天津港口医院就诊的患者114例, 其中冠心病患者60例, 男33例, 女27例, 年龄43~82岁, 均符合世界卫生组织(WHO)诊断标准; 其余54例血脂、血糖水平正常但有动脉粥样硬化疾病家族史的患者作为患者对照组, 男29例, 女25例, 年龄38~79岁。正常对照组55名为健康献血员, 男29名, 女26名, 年龄39~80岁, 均无冠心病、糖尿病、高脂血症及高血压史。患者组与对照组间年龄、性别差异均无统计学意义(P> 0.05)。

1. HPLC 采用日本岛津公司LC-6A型HPLC仪及RF535型荧光检测器。

2. 酶转换法 该法原理是通过特异的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶催化Hcy转变为S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH), 再加入荧光标记的单克隆抗体, 孵育后, 检测荧光强度来判读Hcy浓度。检测范围为2~80 μ mol/L; 参考范围为< 15.0 μ mol/L。试剂盒由山东济南杏恩生物科技有限公司提供。仪器为OP-162荧光检测仪(无锡市欧普兰科技有限公司生产), 激发波长为660 nm, 发射波长为710 nm。

3. 其他项目 葡萄糖(Glu)采用葡萄糖氧化酶法, 甘油三酯(TG)采用酶法, 总胆固醇(TC)采用胆固醇氧化酶法, 均使用日本奥林巴斯AU640全自动生化分析仪及其配套试剂进行检测。

4. 精密度试验 按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS) EP5-A2文件, 取浓度分别为 10和40 μ mol/L的Hcy标准品各1份, 采用酶转换法每天分别检测2次, 连续检测20 d。

6. 干扰试验 将Hcy浓度为15 μ mol/L的混合血浆作为基础血浆, 分别加入不同浓度的脂血(TG浓度为20 mmol/L)、黄疸血[总胆红素(TBil)浓度为300 μ mol/L]及溶血[血红蛋白(Hb)浓度为10 g/L]血浆, 用酶转换法分别检测加入干扰物及未加入干扰物时的Hcy浓度, 连续检测10次, 分析各干扰物对于Hcy的检测是否具有干扰。

7. 回收试验 取Hcy浓度为12.5 μ mol/L的血浆分为3份, 分别加入10、20、30 μ L Hcy浓度为10 μ mol/L的血浆, 用酶转换法进行检测, 分析其回收率。

8. 灵敏度 取校准物A(0 μ mol/L), 用酶转换法每天测定10次, 连续4 d, 分析其检测灵敏度。

9. 方法对比 以HPLC为参考方法, 酶转换法为比较方法, 对2种方法进行配对t检验及相关性分析。

计资料数据均以 x̅± s表示, 不同参数间比较用相关性分析, 组间均数比较采用单因素方差分析, 同一受试对象采用2种不同处理采用配对t检验, 组间两两比较采用q检验; P< 0.05表示差异有统计学意义。所有资料均采用SPSS10.0软件包进行统计学处理。

酶转换法检测Hcy的批内不精密度(CV)分别为1.98%、2.34%, 批间CV分别为2.13%、1.87%, 日间CV分别为2.47%、1.33%, 总CV分别为3.85%、2.41%。

线性回归方程为Y=0.989 1X+0.59, r²=0.987 4; 在2~80 μ mol/L范围内有良好的线性关系。

TG< 20 mmol/L、TBil< 300 μ mol/L、Hb< 10 g/L对酶转换法检测Hcy无干扰(t值分别为1.357、1.286、1.394, P均> 0.05)。

按照回收率(%)= 回收浓度/加入浓度× 100%计算, 回收率为98.9%~102.4%。

取校准物A(0 μ mol/L), 用酶转换法每天测定10次, 连续4 d, 检测结果为(0.07+0.10)μ mol/L( x̅+s), 其分析灵敏度为0.27 μ mol/L( x̅+2s)。

2种方法进行配对资料t检验, 结果t=1.175, t_0.05(59)=1.671, P> 0.05, 2种方法对Hcy的检测无差异。对2种方法进行直线相关分析, 酶转换法与高效液相色谱法相关性较好(r=0.935 2)。

冠心病组及患者对照组血浆Hcy均明显高于正常对照组(P均< 0.01), 冠心病组TG、Glu水平明显高于患者对照组及正常对照组(P均< 0.01)。见表1。

表1

表1

表1 各组Hcy、TG、TC、Glu检测结果 ( x̅± s) 组别 例数 Hcy(μ mol/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) Glu(mmol/L) 正常对照组 55 11.2± 2.7 1.19± 0.41 4.31± 1.27 4.49± 0.58 冠心病组 60 22.6± 2.6* 2.84± 0.42* # 6.17± 0.32 8.17± 0.14* # 患者对照组 54 20.3± 3.1* 1.21± 0.38 4.25± 1.34 4.19± 0.63

表1 各组Hcy、TG、TC、Glu检测结果

注:与正常对照组比较, * P< 0.01; 与患者对照组比较, #P< 0.01

Hcy与Glu、TG呈正相关(r分别为0.447、0.416, P< 0.01), 与TC无相关性(r=0.146, P> 0.05)。

Hcy是一种含硫氨基酸, 是蛋氨酸脱甲基后形成的中间代谢产物。Hcy本身具有内皮细胞毒性作用, 可产生氧自由基和过氧化氢, 从而导致内皮依赖性血管舒张因子缺乏, 血管内皮受损和功能障碍; 可促进血管平滑肌细胞增殖, 引起脂肪、糖及蛋白质代谢紊乱, 促进低密度脂蛋白氧化, 导致血管粥样硬化; 还可促进血栓因子的表达, 使血小板黏附聚集性增加, 并抑制纤溶酶原激活物的产生, 加速血栓形成, 促进冠心病的发生、发展。因此, Hcy对于冠心病的诊断有重要价值^[2]。近年来的研究发现, Hcy的升高是冠心病的一个独立危险因子, 且经冠状动脉造影证实, 高Hcy患者其冠状动脉狭窄率可达41.9%以上^[3]。

目前测定Hcy的方法很多, 主要有HPLC、荧光偏振免疫分析法(FPIA)、酶转换免疫测定法、放射酶分析法、氨基酸分析仪、气相色谱-质谱联用法、酶循环法以及化学发光免疫分析法等^[4], 最常用的为HPLC, 该方法虽然精密度、准确性较好, 但对于技术要求较高, 影响因素较多, 且所需仪器昂贵, 操作费时, 不适于在基层医院普及。

本研究所采用的酶转换法检测Hcy的原理, 类似于美国Abbott公司的FPIA原理, 但不需要大型设备, 操作更为简便。正常人血浆中Hcy的70%左右以二硫键形式与蛋白质结合, 30%左右以低分子量二硫化物形式存在, 仅有1%左右以还原形式存在。该方法首先是利用二硫苏糖醇(DTT)将血浆中的Hcy还原为游离态的总Hcy, 总Hcy在基因重组的SAH水解酶和过量腺苷的作用下, 被转换为SAH, 稀释的SAH加入抗SAH的单克隆抗体及标记的荧光示踪物共同反应, 形成可测量的荧光化合物, 在OP-162荧光检测仪上将该荧光化合物在特定的滤光片波长(660 nm)下激发后, 可在710 nm处发出荧光来检测Hcy。

根据NCCLS文件的要求, 本研究对该方法进行了方法学评价。结果显示, 酶转换法精密度良好, 批内、批间、日间CV均< 2.50%, 总CV为2.41%~3.85%; 在2~80 μ mol/L范围内有良好的线性; TG< 20 mmol/L、TBil< 300 μ mol/L、Hb< 10 g/L时对Hcy的检测均无明显干扰(P均> 0.05), 抗干扰能力较强; 回收率为98.9%~102.4%, 准确度较好; 同时具有较为良好的灵敏度(分析灵敏度为0.27 μ mol/L); 与HPLC相比, 二者无明显差异, 且相关性较好(r=0.935 2)。

本研究利用该方法检测了60例冠心病患者及54例血脂、血糖水平正常但有动脉粥样硬化疾病家族史的患者的Hcy水平, 结果显示这2组患者Hcy水平均高于正常对照组。表明Hcy水平的增高与冠心病的发生具有一定相关性。同时发现冠心病患者其TG水平也高于对照组, 这也反映了高Hcy血症可以引起脂肪代谢紊乱, 加速动脉粥样硬化的形成。冠心病患者Glu水平同样高于对照组, 与Soinio等^[5]研究一致。这可能与Hcy可加速糖基化作用有关, 糖基化终末产物的增加同样可以损伤血管内皮细胞, 加速血栓的形成。相关性分析同样证实, Hcy的升高与TG及Glu水平相关, 而与TC关系不甚密切。另外还发现, 若是血脂、血糖水平正常, 但有动脉粥样硬化疾病家族史的人群, 其Hcy同样处于高水平。此时患者尚无冠心病临床症状, 但Hcy的升高提示这属于高危人群, 临床医师应当进行早期干预, 及时预防并给予适当治疗, 以延缓此类人群冠心病的发生、发展。

利用酶转换法检测Hcy时必须要注意样本的采集与保存, 由于Hcy的检测受红细胞影响较大, 故一定要注意避免溶血样本; 另外, 室温放置样本时间过长也会使Hcy水平升高。因此, 抗凝血样本采集后, 应在1 h内检测, 或即刻分离血浆, 2~8 ℃保存, 72 h内检测。酶转换法检测Hcy具有操作简便、精密度及灵敏度较高、线性范围较好、抗干扰能力强、准确性较好等特点, 且不需购置大型设备, 更适于基层临床实验室推广。