来自天津市人民医院2010年9月门诊糖尿病患者随机尿液, 且患者尿常规干化学定性检测及尿沉渣镜检结果均为阴性。患者符合1999年世界卫生组织(WHO)的糖尿病诊断标准。

免疫透射比浊法使用美国雅培C8000全自动生化分析仪和英国RANDOX MICROALBUMIN试剂盒; 免疫胶体金法使用挪威NycoCard ReaderⅡ 多功能全定量胶体金检测仪和NycoCard U-ALBUMIN 试剂盒; 免疫散射比浊法使用SIEMENS BN ProSpec 特种蛋白分析仪和配套白蛋白测定试剂盒。干扰试验使用日本SYSMEX干扰检查· A试剂盒, 直接胆红素干扰物原浓度为3 370 μ mol/L; 血红蛋白干扰物原浓度为45.6 g/L。尿常规干化学检测使用长春迪瑞H-800全自动尿液分析仪和配套专用尿液试纸条。

预先计算所需要的胆红素及血红蛋白的不同浓度, 并使用糖尿病患者尿液样本作为基础样本。根据SYSMEX干扰检查· A试剂盒说明书, 将血红蛋白干扰物与基础样本以1∶ 20、1∶ 25、1∶ 50、1∶ 75、1∶ 100、1∶ 200和1∶ 400的比例混合, 制成7个不同浓度混合物; 将直接胆红素干扰物与基础样本以1∶ 100、1∶ 150、1∶ 200、1∶ 300、1∶ 500、1∶ 1 000、1∶ 3 000和1∶ 6 000的比例混合, 制成8个不同浓度混合物。用免疫透射比浊法、免疫胶体金法和免疫散射比浊法3种方法分别检测患者样本和各混合物的尿白蛋白浓度, 并计算干扰率。

免疫透射比浊法、免疫胶体金法、免疫散射比浊法分别检测相同基础样本的尿白蛋白浓度均值为87.8、54.5和46.5 mg/L。胆红素对免疫透射比浊和免疫散射比浊检测尿白蛋白结果呈正干扰; 对免疫胶体金法呈负干扰, 结果见表1。血红蛋白对免疫散射比浊法和免疫胶体金法检测尿白蛋白结果主要呈负干扰; 而对于免疫透射比浊法, 当血红蛋白< 0.46 g/L(相当于尿潜血“ ± ” 与“ 1+” 之间)时呈负干扰, 当血红蛋白≥ 0.46 g/L时呈正干扰。结果见表2。

表1

表1

表1 3种方法胆红素干扰试验结果 胆红素干扰物 浓度(μ mol/L) 免疫透射比浊法 免疫胶体金法 免疫散射比浊法 尿白蛋白(mg/L) 干扰率(%) 尿白蛋白(mg/L) 干扰率(%) 尿白蛋白(mg/L) 干扰率(%) 0 (基础样本) 87.8 — 54.5 — 46.5 — 0.56 114.1 18.97 111.0 -2.63 178.5 14.79 1.12 115.6 20.54 118.0 -3.51 176.0 13.18 3.37 116.4 21.38 109.0 -4.38 176.0 13.18 6.74 116.3 21.27 108.0 -5.26 179.5 15.43 10.11 118.0 23.04 109.0 -4.38 181.0 16.39 16.85 117.9 22.94 105.0 -7.89 179.0 15.11 20.22 118.7 23.77 99.0 -13.16 183.0 17.68 30.37 121.8 27.01 98.0 -14.04 183.0 17.68

表1 3种方法胆红素干扰试验结果

表2

表2

表2 3种方法血红蛋白干扰试验结果 血红蛋白干扰物 浓度(g/L) 免疫透射比浊法 免疫胶体金法 免疫散射比浊法 尿白蛋白(mg/L) 干扰率(%) 尿白蛋白(mg/L) 干扰率(%) 尿白蛋白(mg/L) 干扰率(%) 0 (基础样本) 87.8 — 54.5 — 46.5 — 0.11 86.2 -1.82 49.0 -10.09 43.3 -6.88 0.23 85.5 -2.62 49.0 -10.09 42.9 -7.74 0.46 89.3 1.71 48.0 -11.93 42.9 -7.74 0.61 93.7 6.72 45.0 -17.43 42.6 -8.39 0.91 100.2 14.12 47.0 -13.76 42.4 -8.82 1.82 110.9 26.31 45.0 -17.43 42.1 -9.46 2.74 112.2 27.79 43.0 -21.10 41.2 -11.39

表2 3种方法血红蛋白干扰试验结果

微量白蛋白尿指尿中白蛋白超出正常参考值上限而未检出临床蛋白尿的中间阶段。随机尿的白蛋白参考范围多使用20~200 mg/L^[6]。尿液白蛋白检测时, 胆红素和血红蛋白对尿白蛋白检测结果的影响在不同的实验中有不同的结果。如顾晓琼等应用免疫透射比浊法进行了尿白蛋白检测的干扰实验, 结果显示尿中血红蛋白和胆红素对尿白蛋白检测均呈负干扰^[7]; 在Sviridov和Hortin的研究中, 尿液样本中同时含有“ 1+” 蛋白、“ 1+” 胆红素和“ 1+” 酮时, 使用免疫比浊法检测尿白蛋白的结果会低于未加入干扰物前的检测结果^[8]。

本研究选取临床应用广泛的免疫透射比浊法、免疫散射比浊法和免疫胶体金法3种方法进行干扰实验, 所取干扰物浓度范围涵盖了临床上尿常规干化学检测中尿隐血和尿胆红素的部分阳性值, 包括尿隐血“ ± ” (相当于尿中血红蛋白浓度为0.3 g/L)、尿隐血“ 1+” (相当于尿中血红蛋白浓度为0.75 g/L)、尿隐血“ 2+” (相当于尿中血红蛋白浓度2.4 g/L), 以及尿胆红素“ 1+” (相当于尿中胆红素浓度为17 μ mol/L)。免疫胶体金法试剂说明书提示尿液样本中胆红素浓度为85.52 μ mol/L(尿胆红素“ 2+” ~“ 3+” 之间)、血红蛋白浓度为0.05 g/L时未检测出干扰。本研究结果显示在胆红素干扰实验中, 胆红素对免疫胶体金法的干扰最小, 但远低于试剂说明书标注, 当尿胆红素浓度为16.85 μ mol/L(相当于“ 1+” )时, 干扰率为-7.89%; 当尿胆红素浓度为20.22 μ mol/L时, 干扰率可达-13.16%。在血红蛋白干扰实验中, 血红蛋白对免疫胶体金法的干扰最大, 各浓度干扰率均> 10%, 此结果与试剂说明书提示基本一致。这可能与标记物胶体金与形成具有四级空间结构的四聚体血红蛋白发生非特异形结合, 与白蛋白产生竞争反应, 使实验呈现负干扰有关。

胆红素对免疫透射比浊法干扰较大。免疫透射比浊法试剂说明书提示尿液样本中胆红素浓度< 427.61 μ mol/L时, 检测无干扰。本研究中胆红素浓度为1.12 μ mol/L时干扰率已达到20%, 这可能与本研究选用的透射免疫比浊法波长为340nm、缓冲体系为pH值7.4的Tris缓冲液, 与直接胆红素在pH值8.2的Tris缓冲液中的主吸收峰为425~448 nm较接近, 且胆红素在37 ℃温浴10 min后, 在350、600~900 nm处吸光度值上升形成新的吸收峰有关。这可能是由于胆红素作为干扰物, 一方面要对自身的本底吸光度进行干扰, 另一方面胆红素氧化、变构(温度及pH值)、变性(多聚体的形成和四聚体的降解)等一系列效应所致吸收曲线的漂移造成干扰^{[10, 11]}。免疫透射比浊法试剂说明书中未提及血红蛋白的干扰作用。本研究结果表明当血红蛋白浓度≥ 0.46 g/L时呈正干扰, 血红蛋白浓度为0.91 g/L时, 干扰率达14.12%, 并随尿中血红蛋白干扰浓度增加干扰率呈上升趋势。在免疫散射比浊法试剂说明书未提及检测尿白蛋白时胆红素和血红蛋白的干扰作用。本研究中各浓度胆红素对尿白蛋白检测干扰率均> 10%, 随着干扰物浓度增大, 干扰率变化不大; 血红蛋白在3种方法对该法干扰最少, 同样随血红蛋白干扰浓度增加干扰率变化不大, 这可能与该方法采用样本稀释(1∶ 5)法检测, 可消除部分本底干扰有关。本研究结果显示胆红素、血红蛋白对3种临床常用检测尿白蛋白方法均存在干扰, 具体干扰机制有待进一步研究。

临床上, 肾小球肾炎或尿路感染的患者尿中常会出现血红蛋白, 肝细胞黄疸和胆汁淤积黄疸的患者则会排出胆红素尿, 主要成分为直接胆红素。检测含有以上2种干扰成分的尿液白蛋白时会造成检测结果不准确。 如使用免疫透射比浊法检测尿白蛋白时, 尿中很少量的胆红素即会对检测结果产生影响, 尤其是对尿白蛋白检测值处于临界值(20 mg/L)的患者, 不准确的结果很可能会造成误诊或延误治疗。因此, 当尿白蛋白检测值异常及患者尿液有可能会出现血红蛋白或胆红素时, 检验者和临床医生应充分考虑到干扰因素对结果的影响, 并嘱患者在3个月内复查^[2]。

此外尿液基质中还存在各种各样的可能影响白蛋白检测结果的因素, 胆红素和血红蛋白以及其他干扰因素对尿白蛋白检测的影响研究是解决尿白蛋白检测标准化问题中的重要一步。本研究选择的患者基础样本的尿白蛋白浓度处于中低水平, 并且3种方法检测出的尿白蛋白值相差较大, 如免疫透射比浊法检测的平均值几乎比胶体金法的高出一倍。此结果在其他文献中也有所表现, 可能是因为不同方法系统不同试剂的选择会得出较大差异的检测结果^{[8, 12]}。至于此尿白蛋白浓度下胆红素及血红蛋白对其检测结果的影响是否会与在高白蛋白浓度或正常白蛋白浓度下的干扰有无差异, 有待继续研究。