引用本文
郁飞, 李萌, 曹波. ICP-AES法测定全血锰的方法学评价. 2012, 27(7): 561-563
YU Fei, LI Meng, CAO Bo.. Evaluation on the methodology of blood manganese determination by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry. Labratory Medicine, 2012, 27(7): 561-563  
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ICP-AES法测定全血锰的方法学评价
郁飞, 李萌, 曹波
南京医科大学附属南京儿童医院检验科,江苏 南京 210008

作者简介:郁 飞,男,1978年,学士,技师,主要从事微量元素及生化实验工作。

摘要
目的

对电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)测定血锰进行方法学评价,并应用于日常检测工作。

方法

全血样本经1 mol/L硝酸处理后吸取上清液,采用ICP-AES在279.544 nm处测定样本,评价其精密度、回收率、灵敏度及抗干扰能力;同时采用ICP-AES测定1 027名健康体检儿童的全血锰浓度,确定正常参考范围。

结果

ICP-AES测定血锰的批内变异系数( CV)为6.2%~6.6%,批间 CV为7.1%~7.6%,总 CV为7.2%~7.8%,相对偏差(RSD)为1.66%~2.36%,加标回收率为95.0%~96.9%,线性方程为 Y=7 035 .6 X+759 .02, r=0.999 7;在水空白和100 μg/L锰标准储备液中按1∶1分别加入25 mg/L钾、钠、氯、钙、镁标准溶液和2 mg/L铁标准溶液后未检测出锰浓度有明显变化。1 027名健康体检儿童的全血锰正常参考范围为(4.89±2.67)μg/L。

结论

ICP-AES检测全血锰未发现明显系统误差,且精密度高、准确度好,可作为检测全血锰的常规方法。

关键词: 锰; 全血; 电感耦合等离子体发射光谱法; 方法学评价
中图分类号:Q581 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)07-0561-03
Evaluation on the methodology of blood manganese determination by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry
YU Fei, LI Meng, CAO Bo.
Department of Clinical Laboratory,Nanjing Children's Hospital, Nanjing Medical University,Jiangsu Nanjing 210008,China
Abstract
Objective

To evaluate the methodology of determining blood manganese by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry(ICP-AES), and apply the method in daily detection work.

Methods

The whole blood samples were treated with nitric acid, and the concentration of the nitric acid was 1 mol/L. The supernatant fluid was collected. The concentrations of the whole blood manganese were determined by ICP-AES under the condition of 279.544 nm in 1 027 healthy children. The precision, recovery rate, sensitivity and anti-interference ability were evaluated, and the normal reference range was definited.

Results

The within-run coefficient of variation ( CV) was 6.2%-6.6%, the between-run CV was 7.1%-7.6%, and the total CV was 7.2%-7.8%. The relative standard deviation (RSD) was 1.66%-2.36%. The standardized recovery rate was 95.0%-96.9%. The linear equation was Y=7 035.6 X+759.02, and the correlation coefficient of the whole blood manganese was r=0.999 7. The interference elements, K, Na, Cl, Ca and Mg (1∶1, 25 mg/L) and Fe (2 mg/L) were added into the blank solution and the standard reserve liquid of 100 μg/L manganese. The concentration of manganese had no obvious change. The normal reference range of whole blood manganese in 1 027 healthy children was (4.89±2.67) μg/L.

Conclusions

ICP-AES for determining whole blood manganese has no obvious system error. This method is accurate and reliable, and can be applied as a conventional way to detect whole blood manganese.

Keyword: Manganese; Whole blood; Inductively coupled plasma atomic emission spectrometry; Methodology evaluation

全血中的锰元素因浓度低, 个体差异较大, 其测定可能存在方法学上的差异和地区差异等问题[1], 且对测定方法的灵敏度、准确度、抗干扰力和稳定性等方面要求较高。目前国内全血锰检测方法主要是采用原子吸收光谱法(AAS)。该法仪器简单, 但动态线性范围窄、重现性较差。电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)具有较高的精密度与准确度, 可以检测全血样本, 能满足实验室全血锰检测标准化的需求。我们的目标旨在仪器状态稳定、室内总变异系数(CV)≤ 8%的前提下, 完成对全血锰的检测工作。

材料和方法
一、仪器

ULTIMA-2型ICP-AES仪(法国JY公司生产); Milli-Q净化水装置(用于制备实验室去离子水, 密里博中国有限公司生产); DRAGON-MED移液器(南京市计量局每年1次强检, 厂家每年校准1次, 每月1次内校正)。

二、试剂

锰元素标准液及质控品(多元素质控物)由美国SPEX公司提供。浓硝酸由南京化学二厂提供(优级纯)。自制去离子水(≥ 15 MΩ .cm), 供试剂配制和器皿冲洗。

三、全血样本来源及处理

选择南京市儿童医院就诊儿童, 清晨空腹采集静脉血1 mL, 置于硝酸处理过的肝素抗凝管中。取抗凝全血样本0.3 m L加入1.8 mL硝酸(1 mol/L)中, 振荡20~30 s, 1 500× g离心5 min, 取上清液分装于硝酸处理过的试管中待测。

四、试验器皿清洗

所有玻璃器皿, 如移液管、容量瓶等均符合国家A级标准。所有与试剂、水、稀释液或样本接触的玻璃或塑料做如下清洗:(1)使用常规清洗程序(含去污剂热水浸泡, 自来水冲洗); (2)在30%硝酸中浸泡过夜; (3)去离子水冲洗5~10 min; (4)无尘环境中倒置自然干燥。

五、标准储备液配制

1.空白液 以去离子水作为空白液。

2. 100 μ g/L锰标准储备液 25 μ L标准溶液加入250 mL容量瓶定量, 颠倒6次混匀, 静置5 min, 再颠倒6次混匀。使用前重复上述步骤2次。

六、ICP-AES检测程序

1.实验条件 环境温度20~25 ℃, 湿度20%~50%, 电压波动< 5%, 氩气纯度99%, 循环冷却水温23 ℃。仪器高频发生器频率40.68 MHz, 高频输出功率1.2 kW, 反射功率< 5 W, 载气流量1.0 L/min, 等离子气流量12 L/min, 护套气流量0.2 L/min, 提升量1 mL/min, 输入狭缝20, 输出狭缝15, 观测高度10 mm, 积分时间5 s。选择锰的检测共振线279.544 nm, 保证仪器稳定。

2.检测程序 重复检测同一空白液发射光强度, 保证相对偏差(RSD)< 2%。以0、5、10、25 ppm做锰工作曲线的标准分析溶液, 由仪器自动绘制标准曲线, 并对空白液进行20次测定, 仪器自动计算检出限。进入质控样本分析, 重复测定3次, RSD< 2%, 取均值。进入全血样本分析, 每份样本重复测定3次, RSD< 2%, 取均值; 每检测5份样本, 插入1份质控样本, 并保证整个检测过程中质控样本RSD< 2%。

七、评价项目

1. 精密度 将分装好的3份不同浓度全血样本(2009-1B、2009-2B、2009-3B)每日取出1瓶测定, 每瓶为1批, 各检测6批, 每批样本重复检测3次, 计算批内CV、批间CV和总CV。

2.回收率 取血库库血样本, 分装5管, 每管2.5 mL。其中1管做空白, 另4管分别加入浓度为6.25、12.50、25.00、50.00 μ g/L的锰标准液。用上述全血处理方法处理后取上清液测定其回收率。

3. 灵敏度 (1)检测灵敏度:为标准曲线的斜率; (2)检出限:测量空白液20次的发射光强度, 计算标准差(s), 以s的3倍所对应的样本浓度为检测限[2]。检出限(C)计算公式为C=3sd空白/s。

4.干扰实验 因为ICP-AES的分辨率可达0.01 nm, 血液中铅等低浓度元素不会对锰的测定产生干扰, 所以采用全血中浓度较高的钾、钠、氯、钙、镁、铁进行干扰实验。在水空白和100 μ g/L锰标准储备液中按1∶ 1分别加入25 mg/L钾、钠、氯、钙、镁标准溶液和2 mg/L铁标准溶液, 测定锰浓度。

5.儿童全血锰正常参考范围 对来南京市儿童医院进行体检的1 027名健康儿童(男596名、女431名)用ICP-AES测定全血锰浓度。

结 果
一、精密度

全血锰批内CV为6.2%~6.6%, 批间CV为7.1%~7.6%, 总CV为7.25~7.8%。见表1。

表1 ICP-AES测定全血锰的精密度
二、回收率

ICP-AES测定全血锰的回收率结果见表2。

表2 ICP-AES测定全血锰的回收率
三、灵敏度检测

1.检测灵敏度 试验测得锰标准曲线在0~20 μ g/L之间线性良好。以发射光强度为Y, 全血锰浓度为X, 回归方程为Y=7 035.6X+759.02, r2=0.999 7。见图1。

2.检出限 根据公式, 仪器自动计算得出样本的最低检出限为0.039 μ g/L。

图1 ICP-AES测定全血锰浓度的标准曲线

四、干扰实验

在水空白和100 μ g/L锰标准储备液中按1∶ 1分别加入25 mg/L钾、钠、氯、钙、镁标准溶液和2 mg/L铁标准溶液, 未检出锰元素浓度有明显变化。

五、儿童全血锰正常参考范围

1 027名健康体检儿童的全血锰正常参考范围为(4.89± 2.67)μ g/L。见表3。

表3 1 027名健康体检儿童全血锰浓度(μ g/L)
讨 论

临床对全血锰测定结果的准确度与精密度要求较高。全血锰检测项目首先要考虑的是结果的可靠性, 其次考虑自动化、高效性、样本微量化等因素[3]。对于全血锰的检测, 用光谱法测得的结果与原子吸收或中子活化法测得的结果相比较, 可高出一个数量级[4]。传统的血液微量元素的检测要将血样进行消化处理, 方法繁琐, 并不适用于医院常规的检验工作。ICP-AES检测全血锰的批间精密度为7.2%~7.6%, 回收率为95.0%~96.9%, 检出限为0.039 μ g/L, 线性范围可达20 μ g/L, 已经达到了临床全血锰浓度测定的要求。精密度实验显示ICP-AES重复性好, RSD为1.66%~2.36%; 干扰实验结果显示血液中的其他元素对锰的测定不产生干扰, 完全符合建立测量程序的要求。

ICP-AES的检测技术中影响结果准确度和精密度的因素很多, 主要有定标溶液的准确性、仪器及环境的稳定状态等。校准液的配制本研究采用美国SPEX公司的锰标准液, 用容量瓶稀释定容配制, 整个液体配制过程中严格遵守操作方法, 保证容量瓶、酸和水以及操作环境的干净。有研究表明, 储存超过3 d的空白液的发射光和吸光强度都会明显增加[5], 所以空白工作液和校准液均现配现用, 以减少试剂对实验的影响。

实验条件应满足仪器的使用要求, 主要包括电压、温度、氩气纯度、排风、湿度、循环冷却水温等。对于ICP-AES, 环境的温度和湿度对其检测的影响较大, 如环境温度> 30 ℃、湿度> 80%, 检测峰会出现明显漂移。此外, 循环水温> 30 ℃亦会明显影响发生器功率的稳定, 使得定标结果和检测结果出现漂移(RSD> 2%)。检测前, 仪器点火成功后要稳定30 min以上, 输出功率稳定在0.95 KW, 反射功率< 5 W。

ICP-AES测定全血锰具有准确度好、精密度高、检出限低、费用低的优点。同时, 实验不需要常规的消化处理设备, 减少了试剂的用量和预处理的时间。因此, ICP-AES可以作为临床测定全血锰的常规检测方法。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 李萌, 唐吟岫, 杨玉华. 电感耦合等离子体原子发射光谱法测定血锰及儿童血锰含量调查[J]. 检验医学, 2006, 21(3): 225-227. [本文引用:1]
[2] International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC): Analitical Chemistry Division. Nomenclature, symbols, units and their usage in spectrochemical analysis-V radiation sources[J]. Pure Appl Chem, 1981, 19(6): 395-412. [本文引用:1]
[3] Pybus J, Feldman FJ, Bowers GN Jr. Measurement of total calcium serum by atomic abomic absorption spectrophotometry, with use of a strontium internal reference[J]. Clin Chem, 1970, 16(12): 998-1007. [本文引用:1]
[4] 李桂颖, 李泂. 锰的实验研究[J]. 国外医学医学地理分册, 2000, 21(1): 27-28. [本文引用:1]
[5] 马怀安, 王清涛, 王金英, 等. 血清钙测量参考方法的复现及方法学评价[J]. 中华检验医学杂志, 2009, 32(5): 526-530. [本文引用:1]