引用本文
陈卫群, 黄琛, 詹喜炎, 刘水逸, 余洁, 张红梅, 卢忠心. 白血病患者 RASSF1A基因甲基化状态及其临床意义 . 2012, 27(7): 554-556
CHEN Weiqun, HUANG Chen, ZHAN Xiyan, LIU Shuiyi, YU Jie, ZHANG Hongmei, LU Zhongxin. RASSF1A gene methylation and its clinical significance in leukemia patients . Labratory Medicine, 2012, 27(7): 554-556  
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白血病患者 RASSF1A基因甲基化状态及其临床意义
陈卫群1, 黄琛2, 詹喜炎2, 刘水逸2, 余洁2, 张红梅2, 卢忠心1
1. 武汉市中心医院中心实验室,湖北 武汉 430014
2. 武汉市中心医院检验科,湖北 武汉 430014

作者简介:陈卫群, 女,1968年生,副主任技师,主要从事肿瘤标志物与基因治疗研究。

通讯作者:卢忠心, 联系电话:027-82211532。

基金:国家自然科学基金(81071921); 湖北省自然科学基金(2010CDB09002); 武汉市卫生局基金(WX08D11)
摘要
目的

研究白血病患者骨髓中Ras相关区域家族1A( RASSF1A)基因启动子甲基化状态及其临床意义。

方法

采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS- PCR)检测86例白血病患者和60例非白血病患者对照组骨髓中 RASSF1A基因启动子的甲基化状况,分析不同白血病类型之间的差异。

结果

86例白血病患者中,有12例(13.95%) RASSF1A基因启动子甲基化,而60例非白血病患者骨髓均未检测到甲基化,二者比较差异均有统计学意义( P<0.05)。淋巴系白血病患者 RASSF1A基因甲基化比例(23.1%)明显高于髓系白血病患者(6.4%)( P<0.05)。

结论

白血病患者骨髓中存在 RASSF1A基因甲基化,淋巴系白血病甲基化比例明显高于髓系白血病。 RASSF1A基因甲基化检测可能成为白血病分型的生物标志物之一。

关键词: 白血病; Ras相关区域系统1A基因; 甲基化; 生物标志
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)07-0554-03
RASSF1A gene methylation and its clinical significance in leukemia patients
CHEN Weiqun1, HUANG Chen2, ZHAN Xiyan2, LIU Shuiyi2, YU Jie2, ZHANG Hongmei2, LU Zhongxin1
1. Central Laboratory, the Central Hospital of Wuhan, Hubei Wuhan 430014, China
2. Department of Clinical Laboratory, the Central Hospital of Wuhan, Hubei Wuhan 430014, China
Abstract
Objective

To research Ras association domain family 1A ( RASSF1A) gene promoter region methylation in bone marrow of leukemia patients and its clinical significance.

Methods

Methylation of RASSF1A gene promoter region was detected by methylation specific polymerase chain reaction (MS-PCR) in the bone marrow of 86 leukemia patients, and the difference of different kinds of leukemia was analyzed. A total of 60 non-leukemia subjects were enrolled as controls.

Results

Twelve of 86 (13.95%) leukemia patients had RASSF1A gene promoter region methylation. No methylation was found in bone marrow of the control group, and there was a statistical significance ( P<0.05). RASSF1A gene methylation ratio in lymphoid leukemia (23.1%) was higher than that in myeloid leukemia (6.4%)( P<0.05).

Conclusions

Leukemia patients have RASSF1A gene methylation. The ratio of RASSF1A gene methyaltion in lymphoid leukemia is obviously higher than that in myeloid leukemia. RASSF1A gene methyaltion may be a significant parameter for diagnosis and genotyping of patients with leukemia.

Keyword: Leukemia; Ras association domain family 1A gene; Methylation; Biomarker

白血病是造血系统的恶性疾病, 是国内十大高发恶性肿瘤之一。我国白血病患者约为3~4人/10万人。小儿的恶性肿瘤中以白血病的发病率最高, 每年至少以3~4万的速度增加。目前白血病的发病机制尚不十分清楚, 一般认为白血病的发生与理化因子(如核辐射、苯中毒等)有密切的联系。Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因是2000年新发现的抑癌基因, 其甲基化与许多肿瘤相关, 但其与白血病的关系还不清楚。我们以不同类型的白血病患者为研究对象, 用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific polymerase chain reaction, MS-PCR)检测其骨髓RASSF1A基因甲基化水平, 探讨RASSF1A基因甲基化与白血病的发生和变化之间的关系。

材料和方法
一、研究对象

收集86例经骨骼穿刺病理细胞学确诊的白血病患者骨髓, 男41例, 女45例, 年龄22~87岁。其中急性髓系白血病(AML)24例、慢性髓系白血病(CML)23例、急性淋巴系白血病(ALL)19例、慢性淋巴系白血病(CLL)20例。同时收集60例因贫血或发热原因待查经骨骼穿刺病理细胞学确诊为非白血病患者骨髓作为对照组, 男28例, 女32例, 年龄22~80岁。

二、仪器与试剂

QIAamp DNA kit试剂盒购自美国QIAGEN公司; 甲基化修饰试剂盒购于ZYMO RESEARCH 公司; 逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)试剂盒购于TaKaRa公司; 引物由上海生工公司合成; 聚合酶链反应(PCR)仪为美国BIO-RAD CFX96 荧光定量PCR仪; 核酸检测仪为美国Beckman DU730紫外可见分光光度仪。

三、MS-PCR检测RASSF1A基因甲基化

应用QIAamp DNA kit试剂盒提取总DNA, 提取核酸用紫外分光光度计检测纯度, 于-80 ℃保存。按EZ DNA Methylation Kit试剂盒说明将提取的DNA未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶, 转化后的样本进行PCR扩增。引物序列为:甲基化引物5'-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3'和5'-AAC CCCGCGAACTAAAAACGA-3'; 非甲基化引物5'-TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG-3'和5'-CAAACC CCACAAACTAAAAACAA-3'。反应体系为25 μ L, 反应条件为: 95 ℃预变性10 min, 95 ℃变性1 min, 65℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环, 最后一轮72 ℃延伸10 min。扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳后检测。以已知甲基化细胞系K562和非甲基化细胞系RPMI 8226提取DNA混合物作为甲基化和非甲基化的阳性对照, 以不含DNA的水作为阴性对照。

四、统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。组间比较采用卡方检验, P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、RASSF1A基因启动子甲基化检测结果

86例白血病患者骨髓中有12例(13.95%)检出甲基化条带, 而60例非白血病患者均未检出甲基化条带, 二者比较差异有统计学意义(χ 2=9.122, P=0.001)。见图1, 表1。

图1 白血病患者RASSF1A基因启动子甲基化状态

二、RASSF1A基因启动子甲基化与白血病分型的关系

淋巴系白血病患者骨髓中RASSF1A基因甲基化率(23.1%)明显高于髓系白血病患者(6.4%)(P< 0.05)。髓系白血病中AML患者的骨髓甲基化率为8.3%, 而CML患者为4.3%, 二者比较差异无统计学意义(P> 0.05)。淋巴系白血病中ALL患者的骨髓甲基化率为26.3%, 而CLL患者为20.0%, 二者比较差异无统计学意义(P> 0.05)。见表1。

表1 白血病患者RASSF1A基因启动子甲基化状态
讨 论

肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变, 表现为抑癌基因与修复基因的高甲基化与癌基因的去甲基化。基因的甲基化沉默机制有2种:(1)由于启动子区的甲基化导致启动子区结构改变, 启动困难; (2)甲基化引起组蛋白脱乙酰化而致染色质结构改变, 关闭基因[1]。RASSF1A基因是2000年新发现的候选抑癌基因, 位于染色体的3p21. 3。作为Ras的负性调控分子, RASSF1蛋白通过抑制细胞内Cyclin D1聚积、抑制cdc20介导的APC活性、维持微管的稳定等途径诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期进程。RASSF1A基因缺失和启动子区高甲基化是大多数人类肿瘤组织的频发事件, 是RASSF1A基因失活的主要机制[2, 3]。多数肿瘤组织RASSF1A基因启动子区甲基化的发生率为35%~60%, 小细胞肺癌(72%~79%)、肝癌(66.7%~95%)、鼻咽癌(67%~84%)等具有更高的甲基化发生率。非癌组织的RASSF1A 基因未见或仅见极低频率的甲基化[4, 5, 6, 7, 8, 9]。

白血病患者RASSF1A基因启动子甲基化状态的研究较少, 有研究报道在急性白血病中存在15%的RASSF1A基因启动子甲基化[10], 但没有区分哪一类型的急性白血病。本研究结果显示急性白血病中RASSF1A基因启动子甲基化率为16.3%, 与文献[10]报道相近。Johan等[11]研究发现在骨髓增生异常综合症(MDS)和AML中存在较低的RASSF1A基因甲基化率(0%~20%), 其中AML中未发现RASSF1A基因甲基化[11]。本研究发现AML的RASSF1A基因甲基化率为8.3%, 与Johan等[11]的报道不符。这可能与人群选择有关。Avramouli等[12]研究发现在CML中无RASSF1A基因甲基化, 但细胞系K562中存在RASSF1A基因甲基化。本研究也发现在23例CML中仅1例存在RASSF1A基因甲基化(4.3%)。本研究还发现淋巴系白血病RASSF1A基因甲基化率(23.1%)显著高于髓系白血病(6.4%)(P< 0.05); 在髓系白血病中, AML与CML中RASSF1A基因甲基化率差异无统计学意义(P> 0.05); 在淋巴系白血病中, ALL与CLL中RASSF1A基因甲基化率差异也无统计学意义(P> 0.05)。这些研究结果表明白血病患者骨髓中存在RASSF1A基因甲基化, 淋巴系白血病RASSF1A基因甲基化率明显高于髓系白血病, RASSF1A基因甲基化检测可能成为白血病分型的生物标志物之一。

The authors have declared that no competing interests exist.

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