引用本文
蓝锴, 张伟铮, 罗强, 周强, 张文, 唐小龙. 不同方法检测黏液型铜绿假单胞菌药物敏感性结果准确性探讨. 2012, 27(7): 544-548
LAN Kai, ZHANG Weizheng, LUO Qiang, ZHOU Qiang, ZHANG Wen, TANG Xiaolong. Accuracy evaluation of different antibiotic susceptibility testing for mucoid isolates of Pseudomonas aeruginosa . Labratory Medicine, 2012, 27(7): 544-548  
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《检验医学》编辑部
不同方法检测黏液型铜绿假单胞菌药物敏感性结果准确性探讨
蓝锴1, 张伟铮2, 罗强3, 周强4, 张文1, 唐小龙1
1.广东省中医院检验科,广东 广州 510120
2. 广东省中医院大学城分院检验科,广东 广州 510006
3. 广东省中医院芳村分院检验科,广东 广州 510370
4. 广东省中医院二沙岛分院检验科,广东 广州 510105

作者简介:蓝 锴,女,1979年生,硕士,主管技师,主要从事临床微生物学检验及细菌耐药分子机制研究。

基金:国家自然科学基金资助项目(81071397); 广东省科技计划项目(2011B031800028)
摘要
目的

探讨黏液型铜绿假单胞菌(PA)药物敏感性检测方法准确性,以找出适合临床开展的、准确的药物敏感性检测方法。

方法

分别用药物敏感性纸片琼脂扩散法(K-B法)、假单胞菌和非发酵菌药物敏感性试剂盒(ATB PSE5)、仪器法(MicroScan WalkAway 96 plus和VITEK 2)和微量肉汤稀释法同时检测66株黏液型PA,以微量肉汤稀释法作为参考方法,其余方法作为测试方法进行对照分析。

结果

K-B法与微量肉汤稀释法的完全符合率(CA)为92.63%,严重错误(VME)为0.30%,重大错误(ME)为3.13%,一般错误(MIE)为3.94%;ATB PSE5与与微量肉汤稀释法的CA为88.89%,VME为0.83%,ME为5.83%,MIE为4.44%;MicroScan仪器法与微量肉汤稀释法的CA为89.38%,VME为0.34%,ME为5.19%,MIE为5.07%。 VITEK 2因结果缺失严重未进行比较。

结论

临床常用检测PA药物敏感性的方法中,以K-B法检测黏液型PA最为可靠,但应延长孵育时间至48 h或放至CO2孵箱24 h后读取结果更为直观、准确。

关键词: 黏液型铜绿假单胞菌; 药物敏感性试验; 微量肉汤稀释法; 评价
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)07-0544-05
Accuracy evaluation of different antibiotic susceptibility testing for mucoid isolates of Pseudomonas aeruginosa
LAN Kai1, ZHANG Weizheng2, LUO Qiang3, ZHOU Qiang4, ZHANG Wen1, TANG Xiaolong1
1.Department of Clinical Laboratory, Guangdong Province Chinese Medicine Hospital, Guangdong Guangzhou 510120, China
2. Department of Clinical Laboratory, Daxuecheng Branch, Guangdong Province Chinese Medicine Hospital, Guangdong Guangzhou 510006, China
3. Department of Clinical Laboratory, Fangcun Branch, Guangdong Province Chinese Medicine Hospital, Guangdong Guangzhou 510370, China
4. Department of Clinical Laboratory, Ershadao Branch, Guangdong Province Chinese Medicine Hospital, Guangdong Guangzhou 510105, China
Abstract
Objective

To investigate the accuracy of different methods of antibiotic susceptibility testing for mucoid isolates of Pseudomonas aeruginosa (PA).

Methods

A total of 66 isolates of mucoid PA were detected by Kirby-Bauer (K-B) method, ATB PSE5 kits, MicroScan WalkAway 96 plus, VITEK 2 and micro-broth dilution method. The micro-broth dilution method was adopted as reference method, and the other methods were as test methods.

Results

Compared to micro-broth dilution method, the complete accordances (CA) of K-B method, ATB PSE5 kits and MicroScan were 92.63%, 88.89% and 89.38%. The very major errors (VME) of the 3 methods were 0.30%, 0.83% and 0.34%, respectively. The major errors (ME) of the 3 methods were 3.13%,5.83% and 5.19%. The minor errors (MIE) of the 3 methods were 3.94%, 4.44% and 5.07%. The results lack in VITEK 2, since the relevant data were not analyzed.

Conclusions

K-B method is a reliable method for mucoid PA antibiotic susceptibility testing, especially prolonging the incubation time to 48 h or incubating in CO2 incubator for 24 h.

Keyword: Mucoid Pseudomonas aeruginosa; Antibiotic susceptibility test; Micro-broth dilution method; Evaluation

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是引起慢性支气管肺炎、支气管扩张并感染等疾病的重要病原菌, 从菌落形态上PA可分为黏液型和非黏液型, 非黏液型PA在渗透压较高、氯化钠较多、磷酸盐较少等环境下容易转化为黏液型。黏液型PA分离率远低于非黏液型菌株, 但一旦感染很难从患者体内清除, 是造成肺囊性纤维化(cystic fibrosis, CF)的重要病原菌[1]。黏液型PA常常对多种抗菌药物存在多重耐药性, 在实验室培养生长较为缓慢, 使得体外药物敏感性试验的难度大为增加。目前已知抗菌药物治疗可以显著提高CF患者的预后, 为了解黏液型PA最佳的药物敏感性检测方法, 我们采取不同方法对临床分离到的黏液型PA进行药物敏感性试验, 以期为临床提供治疗黏液型PA准确、快速的抗菌药物使用信息。

材料和方法
一、菌株来源

收集广东省中医院及其芳村、大学城和二沙岛分院从2009年10月至2010年10月期间住院患者各类临床标本中分离的黏液型PA菌株, 共66株。同一患者不同部位分离标本不重复纳入。

二、仪器与试剂

MicroScan WalkAway 96 plus 及其配套革兰阴性杆菌药物敏感性板条(NM30)为西门子公司产品; VITEK 2及其配套非发酵菌药物敏感性板条(AST-GN10)、非苛养非肠道革兰阴性杆菌鉴定试剂盒(API 20NE)及其附加试剂、假单胞菌和非发酵菌药物敏感性试剂盒(ATB PSE5)均为法国生物梅里埃公司产品; 药物敏感性纸片为英国Oxoid公司产品; 15种抗菌药物粉剂购自Sigma-Aldrich公司; 水解酪蛋白胨(MH)琼脂平板购自广州迪景公司。

三、细菌鉴定与药物敏感性试验

全部菌株使用API 20NE进行鉴定。药物敏感性试验采用4种方法进行测定比较, 仪器法所用仪器为西门子MicroScan WalkAway 96 plus 和法国生物梅里埃VITEK 2全自动细菌鉴定及药物敏感性分析仪, 手工法为纸片琼脂扩散法(K-B法)、ATB PSE5药物敏感性试剂盒和微量肉汤稀释法。微量肉汤稀释法不同药物采用不同浓度, 其中环丙沙星、左氧氟沙星浓度为0.06~8 μ g/mL, 美罗培南、亚胺培南浓度为0.25~16 μ g/mL, 庆大霉素、妥布霉素、氨曲南、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟浓度为0.5~64 μ g/mL, 阿米卡星、替卡西林、替卡西林-克拉维酸(15∶ 1)、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦(4∶ 1)浓度为2~256 μ g/mL [2]。

四、药物敏感性结果分析

以微量肉汤稀释法作为参考方法, K-B法和ATB PSE5其余方法作为测试方法。结果共分为4种情况:(1)完全符合率(complete accordance, CA):参考方法和测试方法按2010年美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准[3]进行解释, 结果完全一致; (2)严重错误(very major error, VME):测试方法检测为S, 参考方法检测为R; (3)重大错误(major error, ME):测试结果为R, 参考方法为S; (4)一般错误(minor error, MIE):测试方法为S或R, 参考方法为I; 或测试方法为I, 参考方法为S或R[2, 4]。

结 果
一、仪器法与微量肉汤稀释法检测黏液型PA药物敏感性结果比较

MicroScan WalkAway 96 plus配套NM30卡无替卡西林, 此项不予比较, 具体结果见表1。测试过程中有3株菌完全不生长, 另有部分菌株药物敏感性结果不完整, 故不同抗菌药物参与统计菌株数不尽相同。从表1可以看出, 头孢噻肟出现2例VME, 亚胺培南出现1例VME; 哌拉西林、头孢噻肟、头孢他啶和环丙沙星的CA< 90.00%, 其余抗菌药物仪器法与微量肉汤稀释法检测的CA均在90.00%以上。

表1 仪器法与微量肉汤稀释法检测黏液型PA药物敏感性结果比较

VITEK 2进行黏液型PA检测时, 有15株菌在AST-GN10卡中完全不生长, 药物敏感性结果全部缺失, 有24株菌出现不同程度的抗菌药物检测结果缺失, 因此VITEK 2检测药物敏感性结果不予统计。

二、K-B法与微量肉汤稀释法检测黏液型PA药物敏感性结果比较

所有菌株无一缺失药物敏感性数据, 具体见表2。从表2看出, 氨曲南出现3例VME, 所检测的3种头孢菌素类抗菌药物头孢噻肟、头孢他啶和头孢吡肟的CA< 90.00%, 环丙沙星和美罗培南的CA为100.00%。

表2 K-B法与微量肉汤稀释法检测黏液型PA药物敏感性结果比较
三、ATB PSE5与微量肉汤稀释法检测黏液型PA药物敏感性结果比较

ATB PSE5药物敏感性板条无替卡西林、左氧氟沙星、氨曲南, 因此这3项无法进行比较, 且检测中有6株待检菌对照孔及整个板条无生长, 共60株细菌纳入分析, 具体结果见表3。从表3看出, ATB PSE5试剂盒检测黏液型PA出现6例VME(哌拉西林和哌拉西林-他唑巴坦各3例), 没有一种抗菌药物检测结果与微量肉汤稀释法完全符合。CA> 90.0%的抗菌药物有妥布霉素、替卡西林-克拉维酸、哌拉西林、环丙沙星、亚胺培南和美罗培南。

表3 ATB PSE5与微量肉汤稀释法检测黏液型PA药物敏感性结果比较
讨 论

黏液型PA是PA自然存在的一种特殊形式, 其在细菌表面产生大量黏液, 主要成分为多糖藻酸盐等, 从而可以持续定植、形成生物膜。一旦黏液型PA形成生物膜, 有助于细菌逃逸抗菌药物或宿主防御机制, 引起感染持续存在, 抗菌药物治疗效果不明显等[5]。在实验室检测发现, 对黏液型PA进行常规药物敏感性试验时可能出现不生长或生长缓慢现象, 导致抗菌药物信息缺失, 而且不同检测方法得到的结果往往不尽相同, 难以给临床提供有效的抗菌药物使用信息。本实验室对PA药物敏感性检测多采用仪器法、K-B法和ATB法, 这些方法对于检测正常菌落形态的PA有较好的相关性和准确性, 但对于黏液型PA的药物敏感性检测结果是否准确还有待考证。

K-B法是一种可靠、简便、操作性强的药物敏感性测试方法, 最大的优点在于实验室对于抗菌药物的选择上灵活性极强, 发展至今K-B法操作程序已经非常标准化, 但主要用于快速生长细菌[6]。黏液型PA由于生长较慢, 在孵育18~24 h后往往抑菌圈直径不明显, 给测量带来一定的难度。因此采取Burns等[2]推荐的方法, 将培养基延长孵育至48 h, 孵育48 h与18~24 h检测结果差异无统计学意义。考虑到大部分细菌在微需氧条件下生长更为迅速, 我们把药物敏感性检测方法进行改良, 采用将MH平板放至CO2孵箱培养24 h后进行测量, 得到的药物敏感性结果与标准K-B法检测结果一致。黏液型PA在5%CO2气体条件下培养后菌苔增厚, 抑菌圈边界更明显, 测量时更为直观。从本研究结果来看, K-B法与微量肉汤稀释法的CA最高, 但氨曲南出现3例VME, 出现原因尚待研究。

ATB敏感性试验采用半固体琼脂培养基, 不同的药物敏感性试条含有不同种类的抗菌药物, 每种抗菌药物都设有2个关键性的浓度, 在24 h内通过观察有无细菌生长以判断药物敏感性试验结果。结果可直接判读为敏感、中介或耐药。从我们的检测结果来看, ATB PSE5与微量肉汤稀释法结果的CA最低, 而且出现了6例VME。分析原因可能是ATB PSE5板条上哌拉西林和哌拉西林-他唑巴坦无中度敏感结果, 板条中只有一个检测浓度, 最终结果不是敏感即是耐药, 因此检测结果较易出现偏差。

细菌自动化检测是现代临床微生物药物敏感性检测的发展方向。本研究对于黏液型PA, VITEK 2药物敏感性试验结果完全缺失或部分缺失情况比较严重, 因此未列入统计分析之列。MicroScan仪器法对于生长缓慢细菌进行检测时操作方法与快生长细菌有所区别, 快生长细菌直接用快速接种针/水调制菌液, 而慢生长细菌需预先配置0.5麦氏比浊浓度的菌液, 取100 μ L菌液至快速接种水, 再进行药物敏感性检测分析。因此黏液型PA一般都能得到抗菌药物敏感性试验结果, 仅少部分菌株出现检测结果部分缺失的情况。从得到的结果来看, MicroScan仪器法对头孢噻肟检测准确率较低, 且结果全部是微量肉汤稀释法检测敏感而仪器检测为中度敏感。头孢噻肟还出现了2例VME, 出现这种错误的原因尚未查明, 但提示我们在用同类自动化仪器检测黏液型PA药物敏感性时应对头孢噻肟结果加以注意, 尤其是出现头孢噻肟中度敏感其余抗菌药物结果全部敏感时, 应对头孢噻肟结果进行复查。

总之, 微量肉汤稀释法结果最为准确, 但操作过于繁琐复杂, 不适合临床常规开展。全自动细菌鉴定/药物敏感性分析仪进行黏液型PA常规药物敏感性试验最为简便, 但对于这种形态特殊、生长缓慢的黏液型细菌该仪器存在抗菌药物检测结果部分缺失的情况, 提供的药物敏感性信息不完整。K-B法虽然操作过程较仪器法繁琐, 但结果更为可靠, 而且抗菌药物选择灵活, 能为临床提供更全面可信的抗菌药物使用信息。检测时建议将孵育时间延长至48 h或放至CO2孵箱24 h后读取结果, 便于操作人员观察测量结果, 为临床提供更为准确、可靠的药物敏感性数据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Hϕiby N. Recent advances in the treatment of Pseu-domonas aeruginosa infections in cystic fibrosis[J]. BMC Med, 2011, 9: 32. [本文引用:1]
[2] Burns JL, Saiman L, Whittier S, et al. Comparison of agar diffusion methodologies for antimicrobial susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(5): 1818-1822. [本文引用:3]
[3] Clinical and Laboratory Stand ard Institute. Performance stand ard for antimicrobial susceptibility testing[S]. M100-S20, CLSI, 2010. [本文引用:1]
[4] 罗疏薇, 夏云, 何秀丽, 等. VITEK 2全自动微生物分析系统药敏检测结果准确性探讨[J]. 重庆医学, 2009, 38(19): 2413-2415. [本文引用:1]
[5] Hϕiby N, Ciofu O, Johansen HK, et al. The clinical impact of bacterial biofilms[J]. Int J Oral Sci, 2011, 3(2): 55-65. [本文引用:1]
[6] 徐建国, 梁国栋, 邢来君, 等. 临床微生物学手册[M]. 北京: 科学出版社, 2005: 2154-2181. [本文引用:1]