多年的研究已证明血中HDL的重要功能是促使胆固醇自细胞中外排,将外周的胆固醇逆转运至肝中代谢,从而减少胆固醇在外周血中的蓄积而降低动脉硬化和心血管病的危险性。

大量流行病学资料表明,血中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量与冠心病(CHD)的发生间呈明显的负相关。如Framingham心脏病研究项目的结果显示,HDL-C每减少0.26 mmol/L(10 mg/dL)可使男性的CHD死亡率减少19%、女性减少28%^{[ 1]} 。因此,CHD的治疗也以升高HDL为目标,如有许多研究表明,用他汀类药物可升高HDL-C且使冠状动脉硬化的斑快消退^{[ 2]} 。

但近期的研究却对这一认识提出了疑问。主要的问题是:(1)先天性HDL-C或载脂蛋白(apo) A1明显减低的患者却没有早发的CHD^{[ 3]}。如血浆中卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)缺乏者、apo A1基因的Milano突变者、甚至由ATP-结合匣 A1(ABCA1)转运基因突变而致的Tangier病,其血中几乎检测不到HDL-C和 apo A1,但也均无明显早发的CHD;(2)Framingham心脏病研究项目证明,约40%的CHD事件发生在血浆HDL-C正常的人群中^{[ 4]};(3)研究发现应用升高HDL-C的药物,如贝特类、菸酸类等治疗对动脉硬化患者的临床结局并无明显改善;他汀类和胆固醇转运蛋白(CETP)的抑制剂Torcetrapib可使HDL-C升高50%100%,但大量的临床和血管内超声检查表明,药物并没有减少心血管病的危险性,而且还有升高血压和血中醛固酮的副作用^{[ 5]};另一CETP抑制剂Anacetrapib可升高HDL-C达128%,但未能减少心血管病的危险性^{[ 6]};(4)研究证明人体存在炎症时可改变HDL的性质^{[ 7]},炎症HDL的结构和功能已发生改变。这种改变仅用HDL的定量检测不能被发现^{[ 8]};必须通过其功能的检测才能发现。

以上事实说明HDL存在着异质性,不同的HDL亚组分有着功能上的差异。最近用蛋白组学技术研究发现HDL中含有多达65种蛋白成分,其功能可分为6类^{[ 9]}:(1)组成成分apo A1、apo AⅡ、apo E、apo M等的不同;(2)参与脂质代谢与转运的相关蛋白;(3)形成炎症标志物的蛋白;(4)参与免疫系统的蛋白和补体因子;(5)与生长因子和受体/激素结合的蛋白;(6)与止血和血栓相关蛋白。因此,HDL也就有着多种功能,包括促使巨噬细胞外排胆固醇,将胆固醇逆转运至肝中。这主要是通过2个途径:一是通过B1型清道夫受体(SR-B1),二是通过CETP将CE转运给含apo B的脂蛋白,再由肝脏摄取。后者是人体胆固醇逆转运的主要机制。HDL还具有抗炎、抗氧化、抗血栓形成以及促内皮细胞产生一氧化氮(NO)等功能。可见,传统的只检测HDL的总量显然不能说明他们功能上的差异。进一步检测HDL的亚组分及其功能方能说明问题。

HDL是结构复杂的巨大分子,含有多种蛋白和脂类(分子表面主要有磷脂和非酯化的游离胆固醇,核心含胆固醇酯和甘油三酯等)。按HDL分子的密度、大小、电荷和成分的差异可用不同的技术将其分为不同组分,其功能也有差异。已知小而致密的HDL颗粒与CHD关系密切;而较大的颗粒则有一定的保护功能。故检测HDL的亚组分非常必要。现有的检测技术如下。

1. 依密度差异的分析法 早在1951年Lindgren等就用密度梯度超速离心法分离出密度为1.063~1.125 g/mL 的HDL2和密度为 1.125~1.210 g/mL的HDL3。HDL2与CHD呈负相关,HDL3的负相关更强。但对此结果的评价不一,且该法也难以常规应用。

2. 依分子大小差异的分析法 用非变性聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳(GGE)和自动光密度计可分离出不同的组分。依密度和分子大小的差异可将HDL 颗粒分为5种,即极大(VL-HDL)、大(L-HDL)、中(M-HDL)、小(S-HDL)和极小(VS-HDL)。各组分的临床意义的差异尚待明确^{[ 10]}。

3. 依电荷差异的分析法 常规电泳分析HDL分布在α带,用双相凝胶电泳分析可分出前β1、前β2和前α1、前α2、前α3带的HDL。Asztalos等^{[ 11]}研究表明,CHD患者的前β1和α3较高,而α1、前α3、前α1较低。故CHD与α1及前α3呈负相关,而与α3、前β1呈正相关。

4. 依蛋白成分差异的分析法 HDL中最多的蛋白是apo A1。有研究认为apo A1比HDL更能预示患者在未来发生CHD事件,即使经校正HDL的因素后,apo A1仍与CHD事件呈负相关。含量较少的apo A2与CHD事件呈更强的负相关。HDL可据此而分为含apo A1者(LPA-1)和同时含apo A1、apo A2者(LPA-1∶LPA-2)。大多数人的LPA-1约占1/3,LPA-1、LPA-2约占2/3。前者主要存于 HDL2,后者主要存于HDL3。至于两者与CHD的相关性各项研究结果尚不一致。

5. 核磁共振分光镜分析法 用此技术可分离出大、中、小3种颗粒成分。大和小的颗粒均与经血管造影证实的冠状动脉疾病呈负相关,但也有不同的研究报告^{[ 12]}。HDL中的其他蛋白还有apo A-Ⅳ、apo C-Ⅰ、apo C-Ⅱ、apo C-Ⅳ、apo E。他们也存于含apo B的脂蛋白中,故其测定的特异性难以确定。最近也有测定HDL中与炎症、补体调节和天然免疫等蛋白成分的报告,但结果的个体差异太大,难以评价。

检测HDL及其亚组分的功能差异可对解释血浆HDL的量与CHD患者的临床结局不完全一致有所帮助。但目前的功能检测多用于实验动物的研究,部分可望用于人血清的检测。

1. 检测HDL的胆固醇外排和逆向转运的功能 一些研究指出,逆转运的速率与血浆中的HDL-C和apo A1的含量并不一致,可能会存在更复杂的机制。HDL促胆固醇自细胞中外排功能的检测。HDL主要可促使巨噬细胞中胆固醇外排,其功能检测要用培养的活细胞(巨噬细胞)。用³H胆固醇标记细胞,经与血浆中共同温育,然后去除血浆中含apoB的脂蛋白或分离出HDL,再定量沉淀物和上清中的³H胆固醇,计算出外排的³H胆固醇百分含量(%)。另一种非标记方法是测定外排胆固醇的质量(mass)。间接测定胆固醇外排的方法是用乙酰辅酶A∶胆固醇乙酰转移酶来测定被清除胆固醇的酯化量。这些试验的影响因素很多,包括所用的供体细胞、受体的性质、所测的指标等,故尚难于推广。

2. 检测胆固醇被LCAT酯化的功能 经典的逆转运途径是在胆固醇转运至肝脏前由LCAT将外排的胆固醇酯化。LCAT缺乏会使HDL-C明显减低。因此,在理论上,测定血浆LCAT活性可以提供患心血管病危险性的信息。目前LCAT的测定方法还没有标准化。有一种方法是将含放射性物质标记的游离胆固醇的apo A1/磷脂的外源性底物与血浆共同温育,再分离游离和酯化胆固醇进行测定,计算出胆固醇酯化的百分含量(%),此方法为LCAT活性试验。另一种方法是将放射物质标记的游离胆固醇直接与血浆温育,然后再测定酯化胆固醇,计算百分含量(%),此试验为胆固醇酯化速率。最新的方法是测定HDL的分数酯化速率(FER_HDL)。此功能试验是检测去除了含apo B的脂蛋白后经LCAT介导的游离胆固醇酯化速率^{[ 13]}。又有学者据此提出可用动脉硬化指数(AIP)来表示FER_HDL,定义为log(TG/HDL-C)。这样就提供了简便的、易于临床应用的计算法。研究证明HDL颗粒越小,其酯化速率越快,而较小的颗粒酯化速率慢,故FER_HDL也可间接地反映HDL颗粒大小,与心血管病的危险性有直接关系。最近,我国学者建立了用高效液相色谱技术测定血清HDL-C的FER_HDL和摩尔酯化速率(MER_HDL))的方法,且测定了70名健康者的数据,为简便、有效地研究和应用打下基础^{[ 14]}。

3. 检测胆固醇经CETP运输的功能 CETP介导的胆固醇酯由HDL向含apo B脂蛋白转移至肝中。CETP基因变异是影响血中HDL浓度的重要因素。但检测CETP的质量与CHD的关系不明确,用CETP的活性测定可能更有意义。有报道称CETP活性增高可促进动脉硬化和心血管病的发生。

4. 检测HDL的抗炎功能 HDL具有抗炎功能,但经氧化修饰的HDL可转变为促进炎症。氧化的HDL可抑制经细胞因子刺激的内皮细胞表达的黏附因子上调。用经培养的内皮细胞与HDL共温育,再用促炎因子刺激内皮细胞后测定其表达的可溶性细胞间黏附因子1(ICAM-1)和血管内细胞黏附因子1(VCAM-1)的量,从而了解HDL的功能改变。此试验已用于升高HDL药物的研究。

5. 检测HDL的抗氧化功能 HDL中的apo A1可清除人动脉壁细胞的过氧化脂质,HDL中有氧化磷脂功能的对(副)氧磷酶 (paraoxonase,PON1)可抗氧化,但也可被氧化,其氧化修饰是导致其功能改变的重要原因。髓过氧化物酶(MPO)介导的 HDL/apo A1选择性氧化使 apo A1的酪氨酸、赖氨酸氧化,从而降低 HDL/apo A1的胆固醇运输功能。PON1测定可反映HDL的某些抗氧化功能,如防止HDL和低密度脂蛋白(LDL)的脂质过氧化。目前,已有PON1的测定方法介绍^{[ 15]},初步证明其可反映HDL功能且可作为心血管病和脑梗死的生物标志物^{[ 16]}。

6. HDL其他抗动脉硬化功能的检测 HDL可刺激内皮细胞产生一氧化氮(NO)而增强内皮细胞功能。但目前测定内皮细胞原位产生NO尚有困难。现发现这一功能依赖于内皮的溶酶体磷脂受体——磷酸Sphingosin-1。测定此受体可反映HDL的促NO形成功能。此外,HDL还具有抗血凝的功能,其与血小板因子和凝血因子相互作用的试验正在发展中。

HDL的异质性决定了其生物效应的复杂性。目前许多研究表明,在正常及疾病状态下HDL的组成成分不同、颗粒大小不同,其抗动脉粥样硬化及CHD的作用也有明显差异。因此,仅检测HDL在血清中的含量有明显不足。HDL的各种功能检测对揭示其作用机制具有重要意义。

HDL功能的检测与评价目前尚无公认的、临床可用的方法。我们介绍了几种正在研究中的技术,希望能引起临床检验医学家的重视,积极参与到HDL功能检测法的研究中来,以明确在正常和病理情况下HDL的作用机制。既可丰富这一临床最常见检验项目的应用价值,又可明确其切实的作用机制。