引用本文
肖艳群, 蒋玲丽, 金中淦, 王雪亮, 王华梁. 定量PCR HBV DNA室间质量评价可接受范围的探讨. 2012, 27(6): 503-505
XIAO Yanqun, JIANG Lingli, JIN Zhonggan, WANG Xueliang, WANG Hualiang. Investigation on acceptable range of external quality assessment of quantitative PCR for HBV DNA detection. Labratory Medicine, 2012, 27(6): 503-505  
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定量PCR HBV DNA室间质量评价可接受范围的探讨
肖艳群, 蒋玲丽, 金中淦, 王雪亮, 王华梁
上海市临床检验中心,上海 200126

作者简介：肖艳群,女,1964年生,学士,副主任技师,主要从事临床免疫和分子生物学质量控制管理工作。

摘要
目的

探讨定量聚合酶链反应(PCR)HBV DNA 室间质量评价合理的可接受范围,使室间质量评价能更真实地反映和监控实验室检测能力。

方法

由上海市临床检验中心安排人员对51家临床实验室进行5个样本HBV DNA项目的飞行检查,3 h后由调查人员现场带回检测结果并对结果进行统计分析。使用单位数≥10家的试剂以A、B、C表示,以试剂分组,分别比较各试剂组的检测结果、组均值和不同浓度样本标准差(s)和变异系数(CV)的差异,并分别用组均值±3s、组均值±0.5log10和溯源至国家标准品得出的检测值换算成的对数值±0.4 3种评价方式对实验室检测结果进行评价。

结果

各试剂组检测结果之间有差异,A试剂组与B试剂组比较,1142、1144、1145样本检测结果差异有统计学意义(P均<0.05),与C试剂组比较,1144、1145样本检测结果差异有统计学意义(P均<0.05);A试剂组均值与B、C组比较,或与溯源至国家标准品的测定值(单位为IU/mL,结果用对数值表示)比较,1144、1145差值均超过了0.4;4个不同浓度样本其s和CV均超过了允许总误差为0.4时的s和CV。3种评价方式评价实验室成绩合格率分别为100%、88.2%、64.7%。

结论

采用组均值±3s为定量PCRHBV DNA 室间质量评价的可接受范围更合理,更能真实地反映和监控实验室检测能力。

关键词: 乙型肝炎病毒; DNA; 聚合酶链反应; 室间质量评价; 可接受范围
中图分类号:R373.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)06-503-03
Investigation on acceptable range of external quality assessment of quantitative PCR for HBV DNA detection
XIAO Yanqun, JIANG Lingli, JIN Zhonggan, WANG Xueliang, WANG Hualiang
Shanghai Center for Clinical Laboratory,Shanghai 200126,China
Abstract
Objective

To investigate the reasonable acceptable range of external quality assessment of quantitative polymerase chain reaction(PCR) for hepatitis B virus(HBV) DNA detection, and make the external quality assessment more truly reflect and monitor the detection capabilities of clinical laboratories.

Methods

Shanghai Center for Clinical Laboratory arranged a flight check for HBV DNA with 5 quality control samples,which were distributed to 51 participating clinical laboratories. After 3 hours,the test results of all participants were brought back and analyzed by investigator. The reagents were classified into A, B and C groups, according to the number of hospital using ≥10. The results,group mean values, sample standard deviations (s) ith different concentrations and coefficients of variation(CV) among various reagent groups were compared, respectively. The value of logarithm±0.4 calculated from group mean value±3s, group mean value±0.5log10 and test values traceable to national standards was used to evaluate the detection results of clinical laboratory.

Results

The detection results of clinical laboratories among various reagent groups had significant difference. Compared with the B reagent group,the A reagent group detection results of sample 1142,1144 and 1145 were statistically significant (P<0.05). Compared with the C reagent group, the A reagent group detection results of sample 1144 and 1145 were statistically significant (P<0.05). When comparing the A reagent group mean value with the B and C reagent group mean values, or the test values traceable to national standards (the results indicated as logarithm value, and the unit was IU/mL), the difference of sample 1144 and 1145 exceeded 0.4, and the samples ands andCV of 4 different concentration samples all exceeded the samples andCV with an allowable total errors of 0.4. The pass rates of participating laboratories which were evaluated by the 3 kinds of methods were 100%, 88.2% and 64.7%, respectively.

Conclusions

The mean value±3s used for acceptable range of external quality assessment of the quantitative PCR for HBV DNA detection is more reasonable, and can truly reflect and monitor the detection capabilities of clinical laboratories.

Keyword: Hepatitis B virus; DNA; Polymerase chain reaction; External quality assessment; Acceptable range
引言

室间质量评价是评价临床实验室检测质量、促进实验室提高检测结果可靠性与准确性的有效手段[ 1]。室间质量评价涉及靶值和评价区间的设定等问题。临床生化、临床血液学以及内分泌激素、肿瘤标志物等检测项目的可接受范围[(允许总误差(TEa)]采用影响最广的美国1992年颁布的临床实验室修正案(CLIA’88)中规定的要求。而定量聚合酶链反应(PCR)检测HBV DNA室间质量评价的可接受范围缺少通用的国际标准。欧洲大多数国家和地区采用组均值±0.5 log10的标准,美国临床病理家学会(CAP)采用组均值±3 s的标准,而国内卫生部临床检验中心采用溯源至国家标准品得出的检测值换算成的对数值±0.4为可接受的范围,不对检测试剂进行分组。为了建立更为合理的PCR室间量质评价 可接受范围,使室间质量评价更能真实地反映和监控实验室检测能力,我们利用飞行检查的检测结果对3种评价方式进行分析。

材料和方法
一、样本来源

1141、1142、1145样本来源于乙型肝炎患者血浆,无溶血和脂血,1144样本为1145样本用阴性血浆100倍稀释后的样本。所有样本-20 ℃保存备用。同时,为了观察室内、室间变异系数( CV)的差异,选择了与本中心统一发放的HBV DNA 室内质控品浓度接近的样本。

二、样本发放

由上海市临床检验中心分子生物学室人员用专用样本运送箱将HBV DNA样本冷藏运至各医院PCR实验室,要求3 h内完成样本检测,调查人员要求进行检测全过程观察并将检测结果和原始记录带回中心,51家PCR实验室均通过了卫生部或上海市临床检验中心组织的技术验收。

三、评价方法

1. 为了统计方便,将实验室回报的检测结果和溯源至国家标准品得出的检测值均由IU/mL换算成对数值进行分析。

2. 此次飞行检查实验室使用的试剂均采用国产试剂,使用单位数≥10家的试剂以A、B、C表示。将实验室的检测结果按试剂分组,使用单位数≥10家归为一组,统计每个样本各试剂组的均值、标准差( s);使用单位数<10家的归为其他组,计算所有参加实验室结果的均值、 s。组均值均为剔除3 s后的均值。根据临床实验室室间质量评价要求,得分80%以上为成绩合格。

得分= 符合的标本数所做的总的标本数×100%

四、统计学方法

使用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,计量资料以 x- ±s表示,组间比较采用非参数检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、3种国产试剂检测HBV DNA结果比较

B和C试剂组检测结果差异无统计学意义,但A与B、C试剂组差异有统计学意义(1143检测结果为阴性),具体见 表1。

表1 不同试剂组检测 HBV DNA结果的 P值比较
二、3种国产试剂组均值和溯源至国家标准品的测定值(简称测定值)比较

A与B、C试剂组均值、测定值比较,1144和1145样本差异较大,均超过了±0.4,具体见 表2。

表2 各试剂组样本均值结果比较
三、不同浓度样本的 s和 CV比较

低浓度样本的 CV高于高值样本,见 表3。

表3 不同浓度样本的 s和 CV比较
四、用3种评价方式评价PCR实验室成绩

51家PCR实验室分别用3种评价方式进行评价,合格率见 表4。

表4 3种评价方式评价51家PCR实验室成绩汇总
讨论

室间质量评价是评价临床实验室检测质量、促进实验室提高检测结果可靠性与准确性的有效手段。室间质量评价涉及靶值和评价区间的设定等问题。CLIA’88明确规定了临床生化、临床血液学以及内分泌激素、肿瘤标志物检测项目的允许总误差(TEa)要求,为质量监督或管理部门开展室间质量评价时使用[ 2]。定量PCR检测项目是新近快速发展的分子生物学检测项目。因此,在CLIA’88的TEa要求中没有相应的规定,缺少通用的国际标准。目前,美国CAP认可计划的HBV DNA项目的评价标准是靶值±3 s的方法,同时以方法组的均值作为靶值;而欧洲大多数国家和地区采用组均值±0.5log10的方法作为评价要求[ 3];国内卫生部临床检验中心采用溯源至国家标准品得出的检测值换算成的对数值±0.4为可接受的范围,并不对检测试剂进行分组[ 4]。

为了分析上述室间质量评价的评价方式,我们在对医院 PCR实验室进行现场督查的同时采用了飞行检查的方式,对HBV DNA 检测项目进行现场检测。飞行检查是本中心检验质量管理的一种独特方式,飞行检查结果能更真实地反映上海地区医院PCR实验室的检测质量。此次飞行检查的样本无溶血、脂血,且全程在低温条件下运送,确保了样本的质量。

采用溯源明确的靶值±固定区间的方法有利于不同的实验室比较检测结果与可溯源标准的一致性,对于测定结果的准确性优势明显。但是,目前国内PCR实验室大多采用国产试剂进行HBV DNA的检测。从 表1的结果可以看出不同的国产试剂其检测结果存在明显差异,中国生物制品检定所庄辉院士的课题组[ 5]在对一种进口和4种国产试剂的性能评价的数据同样显示,国产试剂检测结果也存在明显差异。因此,在我国大多数实验室使用国产试剂进行PCR定量检测的现有情况下,不对试剂分组,采用溯源至国家标准品得出的检测值换算成的对数值为靶值还缺乏一定的基础。

表2结果显示A试剂组均值与B、C试剂组比较,1144和1145样本超过了卫生部临检中心和欧洲规定的0.4或0.5的范围。定量PCR检测的线性范围较宽,从103108 IU/mL不等,采用±0.5log10或±0.4固定区间方式较难兼顾不同浓度样本的变异水平。此次飞行检查的结果显示不同浓度的样本其变异水平不同,范围约为3%9%之间,而美国CAP 2010年第2次和2011年第1次HBV DNA 的反馈结果显示,组均值对数值为2.94、5.51、4.79、5.68时,其 CV分别为9.52、6.53、6.26和3.87,同样提示高浓度和低浓度样本的 CV有明显差异。TEa包括系统误差和随机误差。在不考虑系统误差的情况下(以组均值为靶值),将0.4作为TEa,当靶值对数值在38之间时,不同实验室间的 CV将分别为4.44%、3.33%、2.67%、2.22%、1.91%、1.67%,而实验室的自身室内 CV只有低于上述室间 CV才有可能在室间质量评价中取得较好的成绩。国产PCR试剂均为手工检测试剂,包括DNA提取、加样、扩增等多个步骤,方法的 CV较大。根据医院PCR实验室每月上报至本中心的室内质控数据,HBV DNA对数值为6和4时其室内 CV为3%5%,远达不到2%3%的要求。应用3种不同的评价方式对实验室检测结果进行评价,卫生部临床检验中心采用的评价方式不合格实验室数明显增多。因此,过于严格的评价方式,可能影响质量评价数据的真实性,失去了评价的意义。正是由于PCR测定技术的方法间差异较大。因此,美国CAP认可计划采用了组均值±3 s的评价方式。

由此可见,由于不同国产试剂检测结果不一致,且不同浓度样本其变异存在较大差异的特点,采用组均值±3 s为定量PCR HBV DNA室间质量评价的可接受范围更合理,更能真实地反映和监控实验室检测能力。上海市临床检验中心亦采用此评价方式对室间质量评价和飞行检查HBV DNA项目进行评价。同时,在开展室间质评或飞行检查活动时,选择覆盖较宽检测范围的样本,可能更能发现问题。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[2] 王治国. 临床检验质量控制技术[J]. 第2版. 北京: 人民卫生出版社, 2010: 47-72. [本文引用:1]
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[5] 吴星, 黄维金, 周诚, 等. 五种乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测试剂盒的比较[J]. 中华传染病杂志, 2009, 27(3): 142-146. [本文引用:1]