引用本文
常连刚, 王蕾. 尿α-L-岩藻糖苷酶对糖尿病早期肾损害的诊断价值. 2012, 27(6): 495-499
CHANG Liangang, WANG Lei. The diagnosis significance of urine alpha-L-fucosidase for diabetes mellitus early renal injury. Labratory Medicine, 2012, 27(6): 495-499  
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尿α-L-岩藻糖苷酶对糖尿病早期肾损害的诊断价值
常连刚, 王蕾
肥城矿业中心医院检验科,山东 肥城 271608

作者简介：常连刚,男,1969年生,学士,副主任技师,主要从事临床生物化学研究。

摘要
目的

探讨尿α-L-岩藻糖苷酶(AFU)测定在筛查糖尿病(DM)早期肾损害中的临床应用价值。

方法

将178例2型DM患者按24 h尿微量白蛋白(mAlb)排泄率分为DM无肾病组(79例)、DM早期肾病组(54例)和DM临床肾病组(45例)。应用本室建立的连续监测法检测178例2型DM患者和320名正常对照者尿AFU、mAlb、尿β2-微球蛋白(β2-MG)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)含量,并进行比较。

结果

采用连续监测法检测尿AFU在300 U/L以下线性良好;高、低浓度样本批内变异系数(CV)分别为1.69%、1.26%,批间CV分别为4.51%、3.52%。维生素C、胆红素和血红蛋白分别为50 mg/L、136.8 μmol /L和1 g/L时对尿AFU不产生干扰。DM组尿AFU、mAlb、β2-MG、NAG分别为(2.87±0.91) U/ g·Cr、(67.62±21.27) mg/g·Cr、(0.48±0.32)mg/ g·Cr、(29.23±8.29)U/ g·Cr,均明显高于正常对照组[(0.82±0.45)U/ g·Cr、(11.54±8.81)mg/ g·Cr、(0.11±0.07)mg/ g·Cr、(9.08±5.21)U/ g·Cr](P<0.01)。DM 3个亚组之间尿AFU、mAlb、β2-MG、NAG差异均有统计学意义(P<0.01)。DM患者尿AFU与NAG呈高度正相关(r=0.859,P<0.01)。79例DM无肾病组尿AFU阳性率高达19.0%,特异性为85.7%,敏感性为91.8%,Youden指数为0.77,诊断效率89.9%。99例DM肾病患者治疗后AFU水平为(2.7±1.26)U/ g·Cr,明显低于治疗前[(4.6±1.72)U/ g·Cr ](P<0.01)。

结论

尿AFU测定是筛查DM早期肾损害的一项有价值的指标。

关键词: α-L-岩藻糖苷酶; 尿液分析; 糖尿病; 肾损害
中图分类号:R446.12 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)06-495-05
The diagnosis significance of urine alpha-L-fucosidase for diabetes mellitus early renal injury
CHANG Liangang, WANG Lei
Department of Clinical Laboratory,Feicheng Mining Central Hospital,Shandong Feicheng 271608,China
Abstract
Objective

To investigate the clinical application significance of urine alpha-L-fucosidase (AFU) for screening early renal injury of diabetes mellitus (DM).

Methods

The 178 type 2 DM patients were classified into DM without nephropathy group(79 cases),DM with nephropathy in early stage group(54 cases) and clinical DM with nephropathy group (45 cases), according to the 24 h urine microalbumin(mAlb) excretion rate. A total of 178 type 2 DM patients and 320 healthy subjects were enrolled in this study. By the continuous monitoring method established by our laboratory, the urine AFU,urine mAlb,urine beta2-microglobulin(β2-MG) and N-acetyl-beta-D-glucosaminidase(NAG) contents were detected. The results between the 2 groups were analyzed comparatively.

Results

The linearity of the AFU determination was up to 300 U/L.The within-run coefficients of variation(CV) of high and low AFU concentration samples were 1.69% and 1.26% respectively.The between-runCV of high and low AFU concentration samples were 4.51% and 3.52% respectively.There was no interference for urine AFU when vitamin C, bilirubin and hemoglobin were 50 mg/L,136.8 μmol /L and 1 g/L.Compared with the control group[(0.82±0.45) U/ g·Cr,(11.54±8.81)mg/ g·Cr,(0.11±0.07)mg/ g·Cr and (9.08±5.21)U/ g·Cr],the urine AFU, mAlb,β2-MG and NAG significantly increased [(2.87±0.91)U/ g·Cr,(67.62±21.27) mg/ g·Cr, (0.48±0.32) mg/ g·Cr and (29.23±8.29) U/ g·Cr] in DM group (P<0.01). The urine AFU, mAlb, β2-MG and NAG among the 3 groups of patients with DM were statistically significant (P<0.01), and the urine AFU was positively correlated with NAG in patients with DM(r=0.859,P<0.01). In the DM without nephropathy group, the positive rate of urine AFU was 19.0%, with specificity 85.7%, sensitivity 91.8%,Youden index 0.77 and diagnostic efficiency 89.9%.The level of urine AFU after the treatment in the DM with nephropathy group (99 cases)[(2.7±1.26)U/ g·Cr] was significantly lower than that before the treatment[(4.6±1.72)U/ g·Cr ](P<0.01).

Conclusions

The determination of urine AFU is a valuable indicator for screening early renal injury of DM.

Keyword: Alpha-L-fucosidase; Urine analysis; Diabetes mellitus; Renal injury
引言

近年来,随着生活水平的提高和生活方式的改变,2型糖尿病(diabetic mellitus,DM)的发病率逐年升高。2010年杨文英等[ 1]发表了我国14个省市4.6万人的DM流行病学调查报告,估算中国现有DM患者9 240万例,居全球之首。DM伴随而来的慢性并发症给社会和家庭带来极为沉重的经济负担。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是常见的慢性并发症之一,在美国DM患者中DN的发生率占38%,是终末期肾衰的首位[ 2]。DN发病较隐匿,一旦形成,治疗较为困难,因此,早期发现肾损害非常重要。α-L-岩藻糖苷酶(α-L-fucosidase ,AFU)是一种溶酶体酸性水解酶,在肾脏近端肾小管上皮细胞溶酶体含量最为丰富。当肾小管上皮细胞损伤时,尿中AFU含量可增高。本研究通过测定DM患者尿液AFU水平,并与尿微量白蛋白(urinary microalbumin ,mAlb)、尿β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase ,NAG)进行联合测定并比较,旨在探讨尿液AFU测定在DM早期肾损害及疗效判定等方面的应用价值。

材料和方法
一、研究对象

1. DM组 178例DM患者均为2008年至2011年肥城矿业中心医院就诊患者,其中男82例,女96例,年龄24~82岁。患者均按1999年世界卫生组织(WHO)DM诊断标准确诊。病程1~36年,平均(12.5±5.1)年。根据DM患者24 h尿微量白蛋白排泄率(urinary albumin excretion,UAE)将其分为3组:(1)DM无肾病组79例,UAE<30 mg/24 h;(2)DM早期肾病组54例,UAE为30~300 mg/24 h;(3)DM临床肾病组45例,UAE>300 mg/24 h。对DM早期肾病和DM临床肾病患者进行治疗前、后的对比观察。以上DM患者均排除高血压病、非糖尿病性肾病疾患、泌尿系感染、肝脏疾患、Graves病及胶原性疾病等,近期未使用肾毒性药物。

2. 正常对照组 选择肥城矿业中心医院健康体检者320名,其中男155名、女165名,年龄18~72岁。临床已排除DM、肾脏疾病和高血压病,空腹血糖检测<6.1 mmol/L,其余各项检测指标均正常。2组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义( P>0.05),具有可比性。

二、仪器与试剂

仪器为HITACHI 7170S 全自动生化分析仪。尿AFU检测试剂为商购血清AFU试剂盒,AFU、β2-MG、mAlb、NAG及肌酐试剂及校准品均使用北京利德曼公司产品。

三、方法

1. 尿液样本留取 所有对象均留取早晨新鲜中段尿液10 mL至清洁尿容器中,立即送检。离心沉淀10 min取上清液待测,其中尿肌酐测定时需将原尿用生理盐水稀释50倍,测定结果乘以稀释倍数,检测项目均在留取样本后2 h内完成。

2. 尿AFU、β2-MG、mAlb、NAG及肌酐测定 尿AFU测定采用速率检测法,为本室利用血清AFU商购试剂盒在生化分析仪上自行建立的检测尿AFU的方法[ 3],结果以U/L表示。尿NAG测定采用CNP-NAG色原底物动力学方法,结果以U/L表示。尿β2-MG测定采用胶乳免疫比浊法测定,结果以mg/L表示。肌酐测定采用碱性苦味酸法测定,结果以g/L表示。为消除患者尿量变化对检测数据的影响,结果采用尿AFU、mAlb、β2-MG 、NAG与尿Cr比值的形式表示,其单位分别为U/ g·Cr、mg/ g·Cr、mg/ g·Cr、U/ g·Cr。以上所有操作均严格按照说明书进行,且对所有项目进行校准后和室内质控结果在控的情况下再行测定。

四、方法学评价

1. 线性范围 将1份AFU高值(300 U/L)尿液样本用生理盐水作1∶0、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16倍比稀释后进行检测。

2. 精密度 取高、低值尿液样本各1份,分别作批内和批间重复性测定。批内重复测定20次,作为批内重复观察指标;将样本-20 ℃分装冷藏,每天重复测定3次,连测6 d,作为批间重复性观察指标。

3. 干扰试验 参考美国临床实验室标准化协会(CLSI) EP7-A2文件[ 4] 对该法进行评价。在已知AFU活性的尿液中分别加入不同浓度的胆红素(0、17.1、34.2、68.4、136.8μmol/L)、血红蛋白(0、0.13、0.25、0.50、1.00g/L)、维生素C(0、6.3、12.5、25.0、50.0 mg/L)做干扰试验。

4. 灵敏度 检测AFU浓度为50 U/L时的吸光度( A)值。

五、统计学方法

所有统计使用SPSS 17.0 统计软件进行分析,正态分布数据用 x- ±s表示,2组间均数的显著性差异采用 t检验,多组均数的显著性检验采用单因素方差分析,相关性分析用直线相关处理,计数资料的比较采用 χ2检验, P<0.05表示差异具有统计学意义。

结果
一、方法学评价

1. 线性范围 将1份AFU高值(300 U/L)尿液样本用生理盐水作倍比稀释后测定,结果表明AFU在300 U/L以下线性良好。

2. 精密度AFU高、低值批内变异系数( CV)分别为1.69%、1.26%;批间 CV分别为4.51%、3.52%。

3. 干扰试验维生素C、胆红素和血红蛋白分别为50 mg/L、136.8 μmol /L和1 g/L时对测定尿AFU不产生干扰。

4. 灵敏度 AFU浓度为50 U/L时, A值变化率≥0.009 ABS/min。

二、正常参考范围

收集正常对照组早晨新鲜中段尿液样本320例,同时测定尿AFU活性和稀释尿Cr含量。正常对照组尿AFU/Cr 比值平均为(0.82±0.45)U/ g·Cr,男性为(0.80±0.43)U/ g·Cr,女性为(0.85±0.47)U/ g·Cr,男、女之间差异无统计学意义( P>0.05),尿AFU正常参考范围( x- ±s)为0~1.73 U/ g·Cr。

三、DM组和正常对照组尿AFU、mAlb、β2-MG 和NAG测定结果见表1。
表1 DM组和正常对照组尿AFU、mAlb、β2-MG 和NAG测定结果 x- ±s
四、DM患者尿AFU与其他指标相关性分析

178例DM患者尿AFU与mAlb、β2-MG及NAG均呈明显正相关( r分别为0.524、0.687、0.859, P<0.01)。

五、尿AFU筛查DM早期肾损害的价值评价

以320名正常对照组NAG正常上限(P95)19.5 U/ g·Cr为筛查标准,超过此标准为肾小管损害。尿AFU以超过正常参考范围上限1.73 U/ g·Cr为筛查阳性,AFU的诊断试验评价结果见 表2。尿AFU筛查DM早期肾损害的敏感性91.8%、特异性为85.7%、Youden指数0.77、阳性预测值为93.3%、阴性预测值为82.8%、诊断效率为89.9%,见 表2。

表2 AFU诊断试验评价
六、DM无肾病组尿AFU、β2-MG及NAG联合检测的阳性率

以尿液4项指标的正常参考范围上限作为标准,高于此值即为该指标阳性(参考范围上限分别为尿AFU:1.73 U/ g·Cr、尿mAlb:30 mg/ g·Cr、尿β2-MG:0.3 mg/ g·Cr、NAG:19.5 U/ g·Cr)。在79例DM无肾病患者中共检出20例患者3项指标中1项或多项超出正常参考范围,3项指标联合检测阳性率明显高于单项指标阳性率( P<0.05)。

七、DN患者治疗前、后各项指标比较

99例DN患者经2周的系统治疗,治疗后的尿AFU、mAlb、β2-MG及NAG含量明显低于治疗前( P<0.01),见 表3。

表3 99例DN患者治疗前、后结果比较 x- ±s
讨论

DM患者由于长期的高血糖使非酶糖酰化速率增加,导致组织缺氧,血液黏滞度增高。同时内皮细胞释放内皮素和一氧化氮等血管活性物质使肾小球毛细血管张力变化,引起血流动力学改变,使肾小球处于高滤过状态引起肾损害[ 5]。以往的研究表明,DM肾病不仅有肾小球的损伤,同时普遍存在肾小管的损伤[ 6],包括近端肾小管及远端肾小管,且肾小管的损伤先于肾小球的损伤。DM引起肾小管间质病变主要是高血糖引起的肾小管糖的重吸收导致的近端肾小管肥大造成的结构性改变,其病理形态主要表现为肾小管肥大、肾小管细胞凋亡、基底膜肥厚、肾小管萎缩和不同程度的纤维化等,确切的机制尚不清楚[ 7]。Caramori等[ 8]通过临床研究进行分析后发现伴mAlb的DM患者仅有30%45%在10年内进展到临床DN。由于肾小管中含有多种丰富的酶类,当肾小管发生损伤时,尿中相关酶的活性升高,通过测定尿酶的活性可帮助判断肾小管的早期损伤。近年来,以NAG为代表的尿酶对检测肾脏病变较为理想,测定方法简便易行,具有临床实用性[ 9]。尿NAG升高预示近端肾小管上皮细胞受损,溶酶体破裂释放NAG,是肾小管间质损伤及评价肾功能的敏感指标,且NAG在其他指标改变之前就已经开始升高,与其他指标对比有很高的特异性和敏感性。

AFU在肾近曲小管上皮细胞中含量最高,相对分子质量约270 000390 000,通常不透过肾小球滤膜屏障,正常健康人尿液中AFU活性极低或检测不出,故尿中AFU主要来自肾实质。此酶在尿中稳定,可准确反映肾小管实质细胞损害。我们采用本室建立的尿AFU测定方法,对DM患者进行了检测,并与尿中mAlb、β2-MG及NAG 3项指标进行比较,探讨了尿AFU活性测定的临床应用价值。178例DM患者尿AFU结果明显高于正常对照组( P<0.01),提示尿AFU能反映早期肾损害的存在,其余3项指标亦明显高于正常对照组,与文献报道[ 10] 一致。DM患者组间比较,4项指标结果差异均具有统计学意义( P<0.01),表明尿AFU活性与DM病程有关,随DM病程延长而升高。DM患者尿AFU升高的程度和尿微量白蛋白排泄量、β2-MG和NAG具有较高的相关性,特别是与NAG具有高度正相关性。尿AFU检测的特异性与敏感性均与NAG相近,证明AFU与NAG具有相似的临床意义,Youden指数0.77,诊断效率89.9%,说明该方法确诊疾病的能力较强,诊断价值较高。实验中发现,尿AFU比较敏感,容易出现假阳性,很多单纯性肾病患者,尿中NAG和AFU已经明显增高,但活检时却没有发现病理性损伤,其原因可能是肾小管上皮细胞受到炎性反应介质刺激而增加分泌尿酶量,还没有达到其受损害程度,但尿中检测水平已经升高,出现假阳性结果。还有少部分肾病晚期病例,肾小管已经大量损伤坏死时,尿中AFU不升高反而下降,原因可能是肾小管上皮细胞受损坏死后,已经不能再分泌尿酶而导致其浓度下降。有研究认为[ 11],当肾小管上皮细胞受损而肾小管重吸收能力正常时,尿中酶类活性升高,当肾小管上皮细胞完整性未受到影响而肾小管重吸收功能障碍时,尿中酶类活性正常。因此,尿AFU在肾小管损伤早期敏感性较高,后期敏感性降低。在本研究178例DM患者中,有8例尿AFU活性升高而NAG正常,有10例NAG升高AFU正常;79例尿蛋白排泄正常的DM无肾病患者测定尿AFU、β2-MG及NAG含量,单项阳性率分别为19.0%、11.4%和16.5%,3项联合检测阳性率可达25.3%,显示如果只检测尿mAlb单一指标来筛选DM早期肾损害阳性率偏低,易发生漏诊,在临床应用中应采取多指标联合测定来提高DM早期肾损害的检出率。99例DM肾病患者治疗前、后(两周)尿AFU测定结果显示,治疗后尿AFU和其他3项指标下降非常显著( P<0.01),说明尿AFU活性测定在判定DM肾病疗效和预后亦有一定的指导作用。

综上所述,尿AFU是一项筛查DM早期肾损害的理想指标,无论在特异性、灵敏度和稳定性等方面都值得临床推广应用,特别是在DM早期尿mAlb正常阶段,尿AFU、β2-MG及NAG联合检测有较高的应用价值。

The authors have declared that no competing interests exist.

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