引用本文
杨慧敏, 陈国武. 上海地区原发性男性不育症患者Y染色体AZF基因微缺失的检测 . 2012, 27(6): 479-481
YANG Huimin, CHEN Guowu. Detection of Y chromosomeAZF gene microdeletion in idiopathic infertile males from Shanghai . Labratory Medicine, 2012, 27(6): 479-481  
Permissions
Copyright©2012, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
上海地区原发性男性不育症患者Y染色体AZF基因微缺失的检测
杨慧敏1, 陈国武2
1.上海达安医学检测中心,上海 201203
2.上海集爱遗传与不育诊疗中心,上海 200011

通讯作者：陈国武,联系电话：021-63455468。

作者简介：杨慧敏,女,1972年生,硕士,主管技师,主要从事实验室相关诊断和研究。

摘要
目的

探讨上海地区原发性男性不育症患者无精子因子(AZF)基因微缺失情况及其微缺失特点。

方法

运用聚合酶链反应(PCR)结合琼脂糖凝胶电泳等方法,对上海地区269例原发性男性不育症患者(无精子症38例、严重少精子症231例)以及10名已生育的正常男性进行了AZFa、AZFb和AZFc微缺失筛查。

结果

269例男性不育症患者中发现18例AZF基因STS位点存在缺失,其中14例为AZFc区存在缺失、2例为AZFb+c区存在缺失、1例为AZFa+b+c均缺失、1例为AZFa区存在缺失,总缺失率为6.7%。

结论

AZFc区为原发性不育症患者AZF基因筛查的主要候选基因,临床上对原发性不育患者进行AZF基因缺失筛查仍是十分必要的。

关键词: 原发性男性不育; 无精子症; 少精子症; AZF基因微缺失; 辅助生殖技术
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)06-479-03
Detection of Y chromosomeAZF gene microdeletion in idiopathic infertile males from Shanghai
YANG Huimin1, CHEN Guowu2
1. Shanghai Daan Medical Centre for Clinical Laboratory,Shanghai 201203,China
2. Shanghai Jiai Genetics and IVF Institute,Shanghai 200011,China
Abstract
Objective

To investigate the azoospermia factor(AZF) gene microdeletion and its characteristic in idiopathic infertile males from Shanghai.

Methods

Polymerase chain reaction and agarose electrophoresis were used to detect microdeletion inAZFa,AZFb andAZFc in 38 patients with idiopathic azoospermia, 231 patients with oligozoospermia and 10 healthy controls.

Results

AZF gene STS point microdeletion was found in 18 of 269 infertile patients. There were 14 cases inAZFc,2 cases inAZFb+c, 1 case inAZFa+b+c and 1 case inAZFa. The total prevalence rate of microdeletion was 6.7% .

Conclusions

AZFc is a major gene forAZF gene screening in idiopathic infertile patients.Screening ofAZF gene microdeletion for idiopathic infertile patients is essential.

Keyword: Idiopathic male infertility; Azoospermia; Oligozoospermia; Azoospermia factor gene microdeletion; Assisted reproductive technology
引言

无精子因子(azoospermia factor, AZF)的微缺失是无精子和严重少精子男性常见的基因改变之一。有15%~20%的不育男性发生 AZF基因微缺失。 AZF基因位于Y染色体Yq11上,在Yq11的56间隔中,有许多位点与精子发生有关,被命名为 AZFa、 AZFb和 AZFc[ 1]。为研究本地区原发性男性不育症患者的 AZF基因微缺失情况,我们采用聚合酶链反应(PCR)技术结合琼脂糖凝胶电泳对上海地区原发性男性不育症患者进行了 AZF检测。

材料和方法
一、对象

269例原发性男性不育症患者均来自上海集爱遗传与不育诊疗中心,年龄26~57岁。连续2次精液分析并经离心沉淀均未发现精子者为无精子症,共38例;精子密度<5×106/mL者为严重少精子症,共231例。所有患者均通过临床检查排除生殖道梗阻、精索静脉曲张等其他泌尿生殖系统疾患。以10名已生育的正常男性志愿者作为对照组,年龄30~45岁。

二、方法

1. DNA抽提 抽取所有研究对象外周血2 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,DNA抽提试剂购自中山大学达安基因有限公司,抽提过程按照试剂盒说明书进行。

2. 引物设计与合成 根据欧洲男性不育协会推荐选择8对引物,分别是位于 AZFa区的SY84、SY86 ; AZFb区的SY127、SY134; AZFc区的SY254、SY255。选择位于Y染色体短臂的睾丸决定基因( SRY)和锌指蛋白基因( ZFX/ZFY)为内对照。正常男性和正常女性分别为组间阳性和阴性对照[ 2],引物序列见 表1。

表1 引物序列

3. PCR扩增和检测 PCR反应体积为25 μL,包括gDNA约100 ng、10×buffer 2.5 μL、dNTP终浓度200 μmol/L、10 pmol/μL引物各0.5 μL、DNA聚合酶 1 U。扩增条件95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s,共35个循环,72 ℃延伸5 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳30~45 min,凝胶成像系统观察结果。如发现确认无缺失的对照样本管相应位点存在目的扩增片段,空白扩增管无目的片段存在,则该批次扩增反应在控,否则需重新扩增。在扩增反应在控情况下,检测样本扩增位点发现目的片段,则判断该位点未见缺失,如相应位点扩增后电泳未发现目的片段,则判断该样本此位点存在缺失。

结果

269例原发性男性不育症患者中发现18例 AZF基因STS位点缺失,其中14例为 AZFc区存在缺失,2例为 AZFb+c区存在缺失,1例为 AZFa+b+c区均缺失,1例为 AZFa区存在缺失,总缺失率为6.7%,见 表2。

表2 269例原发性男性不育症患者 AZF基因微缺失检测结果[例(%)]
讨论

无精症和少精症是男性不育的主要原因之一,而无精和少精与遗传因素有密切的关系。研究证明,Y染色体 AZF基因的微缺失与男性原发无精和少精症密切相关。1999年根据大量临床 AZF基因微缺失分子流行病学研究资料,在欧洲形成了标准化的 AZF基因微缺失筛查方案[ 2],并在世界各地得到广泛应用。

目前,国外对 AZF基因区域微缺失的实验筛查主要用于原发性无精症与严重少精症辅助生育精子质量筛选及预后判断。在我国,近年来随着原发性男性不育症就诊率的不断提高和辅助生育规模的扩大,开展临床 AZF基因微缺失检测的必要性日益凸显。然而,从国外文献报道看,各种人群原发性男性不育症Y染色体微缺失的发生率高低不一,提示可能存在种族差异与地域差异现象。因此,在中国的不同地区进行 AZF基因区域微缺失的检测具有重要的理论与实践意义。

目前,国际上报道的 AZF基因缺失率1%~55%[ 3, 4, 5],本研究中原发性男性不育症组 AZF基因微缺失的总发生率为6.7%,位于此范围内。但与国内其他地区报道的数据相比相对偏低[ 6, 7], 其原因之一可能是各个实验患者群体的纳入或排除标准不一,此外可能与实验选择对象来自的地域不同有关,不排除其缺失率存在地域差异的可能。

其次,从 AZF基因区域微缺失的特点看, AZFc区的缺失率为6.3% 与其他2个区域的0.7%和1.1%比较,差异有统计学意义,前者明显高于后者;在发生缺失的患者群体中, AZFc区缺失占94%,这充分提示 AZFc区是整个 AZF区域微缺失的热区。此结论与国内外报道基本一致。同时发现 AZFb区发生缺失时多伴以其他区域同时缺失。虽然本研究无精症与少精症患者的缺失均主要集中在 AZFc区,但发生 AZF微缺失的区域特点还存在一定差异,其中2个区域以上的缺失均表现为无精症,这也充分体现了 AZF各区在精子发生中的重要作用;而 AZFc区缺失表现出不同的临床表型。在本研究中 AZFa区缺失患者表现为少精症,这与以前报道 AZFa区缺失主要以无精症为主有所出入,可能是由于缺失病例太少故无法反映出来所致。

本研究结果表明Y染色体微缺失,特别是 AZFc/ DAZ微缺失是引起严重少精子和无精子从而导致男性不育的重要原因之一。 AZF基因微缺失是导致生精障碍的重要因素。明确无精症与 AZF基因区域微缺失的关系和各种缺失特点将为提高男性不育的诊疗水平奠定扎实的基础。因此,在临床上对原发性不育患者进行 AZF基因缺失筛查是十分必要的。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Vogt PH. Human chromosome deletions in Yq11, AZF cand idate genes and male infertility: history and update[J]. Mol Hum Reprod, 1998, 4(8): 739-744. [本文引用:1] [JCR: 4.542]
[2] Simoni M, Bakker E, Eurlings MC, et al. Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions[J]. Int J Androl, 1999, 22(5): 292-299. [本文引用:2] [JCR: 3.565]
[3] Singh AR, Vrtel R, Vodicka R, et al. A comparative study of AZF deletions and TSPY gene variation in Czech and Indina infertile men[J]. Int J Hum Genet, 2006, 6(3): 209-217. [本文引用:1] [JCR: 0.187]
[4] Choi JM, Chung P, Veeck L, et al. AZF microdeletions of the Y chromosome and in vitro fertilization outcome[J]. Fertil Steril, 2004, 81(2): 337-341. [本文引用:1] [JCR: 4.174]
[5] Shimizu A, Ichikawa T, Suzuki N, et al. Microdele-tions in the Y chromosome of patients with idiopathic azoospermia[J]. Asian J Androl, 2002, 4(2): 111-115. [本文引用:1] [JCR: 2.14] [CJCR: 0.793]
[6] 丁显平, 钟影, 魏霞, 等. 成都地区男性原发性无精症患者Y染色体AZF区域微缺失基因诊断的研究[J]. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 2005, 27(8): 23-24. [本文引用:1]
[7] 刘雅峰, 欧建平, 周灿权, 等. 广州地区不育男性Y染色体无精子因子微缺失的筛查[J]. 中华医学遗传学杂志, 2007, 24(5): 564-566. [本文引用:1]